抑制雄激素受体的双链RNA分子及其应用

本发明涉及生物，特别涉及抑制雄激素受体的双链rna分子及其应用。

背景技术：

1、雄激素受体（androgen receptor，ar）在动物界分布广泛，参与多种生物过程的调控。在雄性生殖系统中，ar主要介导雄激素对靶器官（如前列腺、精囊等）的作用，促进其生长并维持其功能。此外，ar也在维持雄性副性征方面发挥重要作用，如家禽的冠、鸟类的羽毛、反刍动物的角以及人类的须发、喉结等。在人体内，ar作用机制主要通过以下几个步骤：首先，ar和雄激素结合，形成复合物，随后复合物会进入到细胞核中，和dna结合，调节靶基因的转录。此外，ar还可以影响其他信号转导通路的活动，例如pi3k/akt、mapk/erk等通路，从而调节细胞的增殖、分化等生命过程。ar是肿瘤细胞中最常见的激素受体之一，是导致人前列腺癌生长及耐药的重要因素。研究显示，ar在乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肝癌等中亦高表达，并与其对放、化疗耐药相关。

2、rna干扰（rna interference，rnai）是指在进化过程中高度保守的、由双链rna（double-stranded rna，dsrna）诱发的、同源mrna高效特异性降解的现象。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何抑制雄激素受体从而降低肿瘤细胞的耐药性。

2、为了解决以上技术问题，本发明提供了sirna、其修饰物、或其药学上可接受的盐，该sirna是名称为ar-222-human的双链rna分子；

3、所述ar-222-human的一条链从5’端至3’端的核苷酸序列为seq id no.1，所述ar-222-human的另一条链从5’端至3’端的核苷酸序列为seq id no.2。

4、其中，seq id no.1由23个核糖核苷酸组成，seq id no.2由23个核糖核苷酸组成。

5、术语“修饰物”是指对所述双链rna分子进行修饰得到的产物，各种修饰方法均可选用，包括选自核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种的组合等。

6、术语“药学上可接受的盐”指在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的效果/风险比相称的盐。药学可接受的盐是本领域公知的。例如，s.m.berge,et al.,j. pharmaceuticalsciences,1977,66:1中对药学可接受的盐进行了详细描述。

7、下述a1)-a14)和b1）-b13）所示的与所述双链rna分子相关的生物材料也属于本发明的保护范围：

8、a1）产生前文所述双链rna分子的shrna；所述shrna的茎可为所述双链rna分子；

9、a2）编码a1）所述shrna的dna分子；

10、a3）含有a2）所述dna分子的表达盒；

11、a4）含有a2）所述dna分子的重组载体；

12、a5）含有a3）所述表达盒的重组载体；

13、a6）含有a2）所述dna分子的重组微生物；

14、a7）含有a3）所述表达盒的重组微生物；

15、a8）含有a4）所述重组载体的重组微生物；

16、a9）含有a5）所述重组载体的重组微生物；

17、a10）含有a2）所述dna分子的转基因动物细胞系；

18、a11）含有a3）所述表达盒的转基因动物细胞系；

19、a12）含有a4）所述重组载体的转基因动物细胞系；

20、a13）含有a5）所述重组载体的转基因动物细胞系；

21、a14）含有a2）所述dna分子的转基因植物细胞系；

22、b1）编码前文所述双链rna分子的dna分子；

23、b2）含有b1）所述dna分子的表达盒；

24、b3）含有b1）所述dna分子的重组载体；

25、b4）含有b2）所述表达盒的重组载体；

26、b5）含有b1）所述dna分子的重组微生物；

27、b6）含有b2）所述表达盒的重组微生物；

28、b7）含有b3）所述重组载体的重组微生物；

29、b8）含有b4）所述重组载体的重组微生物；

30、b9）含有b1）所述dna分子的转基因动物细胞系；

31、b10）含有b2）所述表达盒的转基因动物细胞系；

32、b11）含有b3）所述重组载体的转基因动物细胞系；

33、b12）含有b4）所述重组载体的转基因动物细胞系；

34、b13）含有b1）所述dna分子的转基因植物细胞系。

35、为解决上述技术问题，本发明还提供了降低肿瘤细胞耐药性或预防和/或治疗肿瘤的组合物，含有前文所述双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐或前文所述生物材料。

36、所述肿瘤细胞为表达雄激素受体的肿瘤细胞；所述肿瘤为表达雄激素受体的肿瘤；所述组合物还含有化疗药物。

37、进一步地，所述化疗药物可为烷化剂。

38、更进一步地，所述化疗药物为咪唑四嗪类烷化剂；

39、在本发明的具体实施方式中，所述化疗药物为替莫唑胺。

40、所述组合物可为雄激素受体抑制剂或药物制剂。

41、在所述组合物中，前文所述双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐或前文所述生物材料与化疗药物可分别单独包装。

42、上文中，所述“雄激素受体抑制剂或药物制剂”的剂型可为气雾剂、片剂、胶囊、滴丸、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂或冻干粉针剂。

43、上文中，所述“雄激素受体抑制剂或药物制剂”的活性成分可为所述双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐。进一步地，根据实际需要，所述“雄激素受体抑制剂或药物制剂”的活性成分还可含有其他物质，其他物质本领域技术人员可根据所述“雄激素受体抑制剂或药物制剂”的药物的效果确定。

44、上文中，所述“雄激素受体抑制剂或药物制剂”除含有前文所述双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐或前文所述生物材料外，还可含有适宜的载体或赋形剂。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料（如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等）、难溶性载体材料（如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等）、肠溶性载体材料（如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等）。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。上述给药途径优选的是注射给药。

45、下述任一应用也属于本发明的保护范围：

46、c1）前文所述的双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐或前文所述的生物材料在制备雄激素受体抑制剂中的应用；

47、c2）前文所述的双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐或前文所述的生物材料在制备用于降低肿瘤细胞耐药性的产品中的应用；

48、c3）前文所述的双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐或前文所述的生物材料在制备用于预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用；

49、c4）前文所述的双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐或前文所述的生物材料或前文所述的组合物在抑制雄激素受体中的应用；

50、c5）前文所述的双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐或前文所述的生物材料或前文所述的组合物在降低肿瘤细胞耐药性中的应用；

51、c6）前文所述的双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐或前文所述的生物材料或前文所述的组合物在预防和/或治疗肿瘤中的应用。

52、所述降低肿瘤细胞耐药性为降低肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。

53、所述药物还可含有化疗药物。

54、所述化疗药物可为烷化剂。所述烷化剂可为咪唑四嗪类烷化剂。在本发明的具体实施方式中，所述化疗药物具体为替莫唑胺（tmz）。

55、本发明还提供了一种体外构建对化疗药物耐药性降低的肿瘤细胞模型的方法。

56、本发明所提供的体外构建对化疗药物耐药性降低的肿瘤细胞模型的方法，可包括如下步骤：降低肿瘤细胞中雄激素受体的表达，得到对化疗药物耐药性降低的肿瘤细胞模型。

57、在所述方法中，具体可利用前文所述的双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐或前文所述的生物材料或前文所述的组合物降低所述肿瘤细胞中所述雄激素受体的表达。

58、本发明还提供了抑制雄激素受体的方法。

59、本发明所提供的抑制雄激素受体的方法，包括给受体动物施用前文所述的双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐或前文所述的生物材料或前文所述的组合物以抑制雄激素受体。

60、本发明还提供了降低肿瘤细胞耐药性的方法。

61、本发明所提供的降低肿瘤细胞耐药性的方法，包括给受体动物施用所述的双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐或前文所述的生物材料或前文所述的组合物以降低肿瘤细胞耐药性。

62、上述方法中，所述施用可为雾化吸入给药。

63、本发明中，所述动物可为哺乳动物，如人。

64、本发明中，所述肿瘤细胞可为表达雄激素受体的肿瘤细胞。所述肿瘤细胞可为实体肿瘤细胞。所述实体肿瘤细胞可为胶质瘤细胞。所述胶质瘤细胞可为脑胶质瘤细胞（如t98g细胞）。

65、本发明的双链rna分子ar-222-human具有以下优点：通过转染sirna敲低人脑胶质瘤细胞—t98g细胞的雄激素受体基因表达得到雄激素受体基因表达被敲低的si222-t98g细胞。与转染阴性对照sirna的t98g细胞（sinc-t98g）相比，cck-8实验表明，si222-t98g细胞对替莫唑胺的耐药性降低；划痕实验和transwell实验表明si222-t98g的迁移能力减弱，说明敲低雄激素受体表达能够降低t98g细胞对替莫唑胺的耐药性。结果表明通过干预雄激素受体精准治疗，可逆转由雄激素受体导致的胶质母细胞瘤对替莫唑胺耐药，为临床提高胶质母细胞瘤治疗效果提供十分重要的研究信息。