负载IL33的溶瘤痘苗病毒及其与免疫检查点抑制剂的联合疗法的制作方法

本发明涉及生物医药工程，具体涉及一种表达人或小鼠il33复制性溶瘤痘苗病毒构建方法，及其与免疫检查点蛋白抑制剂的联合治疗方法。

背景技术：

1、正常组织内稳态是细胞增殖和细胞死亡的高度调控过程。细胞增殖或细胞死亡的失衡可发展成癌态。例如，子宫颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌和脑癌等多种癌症。据《2018年全球癌症统计数据》报告显示，2018年全球有大约1810万癌症新发病例和960万癌症死亡病例，中国新增病例数占380.4万例、死亡病例数占229.6万例。

2、免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,icis)的出现迅速改变了多种癌症的治疗模式，到目前pd-(l)1抑制剂已经成为20多种不同癌症适应症治疗的常规手段。然而，除了在某些疾病中(例如黑色素瘤、默克尔细胞、霍奇金淋巴瘤、msi-h肿瘤)的患者对单药pd-1阻断有较高的响应率(40％-70％)外，大多数其他癌症适应症的缓解率仅为10-25％，即使在最初对icis有反应的患者中，疾病最终也可能进展。

3、同样，溶瘤病毒(oncolytic virus，ovs)是一类新兴的肿瘤治疗药物，能在肿瘤细胞中选择性复制、并递送多种治疗基因、诱导免疫原性细胞死亡(immunogenic celldeath，icd)和促进抗肿瘤免疫。由于ovs可以打破免疫抑制性肿瘤微环境(tumormicroenvironment，tme)，促进免疫细胞被招募到tme中，因此，ovs被认为可以与icis协同提高免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade,icb)的有效性。临床试验研究表明，溶瘤病毒t-vec与pd-1抗体联用比单药pd-1抗体治疗黑色素瘤的客观响应率提高55％，证实了ovs是提高免疫检查点抑制剂响应的一种新的治疗途径。目前已有疱疹病毒t-vec被fda批准治疗黑色素瘤。总体上，溶瘤病毒在临床试验中表现出了可观的安全性和有效性。

4、因此，本领域需要开发新的溶瘤病毒及其与免疫检查点抑制剂的联合治疗方法。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供负载il33的溶瘤痘苗病毒及其与免疫检查点抑制剂的联合疗法。

2、在本发明的第一方面，提供了一种重组溶瘤病毒，所述的重组溶瘤病毒表达白介素33(il33)。

3、在另一优选例中，所述的重组溶瘤病毒选自下组：痘苗病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒(adenovirus)。

4、在另一优选例中，所述的单纯疱疹病毒为单纯疱疹病毒1型(hsv-1)或单纯疱疹病毒2型(hsv-2)。

5、在另一优选例中，所述的痘苗病毒选自下组：痘苗病毒copenhagen株、痘苗病毒western reserve株、痘苗病毒lister株、痘苗病毒wyeth株或痘苗病毒天坛株。

6、在另一优选例中，所述的il33为人或小鼠的il33。

7、在另一优选例中，编码所述人il33的dna序列如seq id no:1所示。

8、在另一优选例中，编码所述小鼠il33的dna序列如seq id no:2所示。

9、在另一优选例中，所述重组溶瘤病毒含有外源的人或小鼠的il33基因。

10、在另一优选例中，所述痘苗病毒的功能性痘苗生长因子f3l区基因全部或部分缺失。

11、在另一优选例中，所述痘苗病毒包含功能性f2l和/或f4l基因。

12、在本发明的第二方面，提供了如本发明第一方面所述的重组溶瘤病毒的制备方法，包括如下步骤:

13、(a)提供待改造的溶瘤病毒；

14、(b)将il33编码核酸引入所述待改造的溶瘤病毒中，从而得到所述的重组溶瘤病毒。

15、在另一优选例中，所述的il33为人或小鼠的il33。

16、在另一优选例中，在步骤b中，通过重组载体将所述的il33编码核酸引入所述待改造的溶瘤病毒中，所述的重组载体含有il33编码核酸。

17、在另一优选例中，所述的待改造的溶瘤病毒为痘苗病毒，优选为痘苗病毒copenhagen株。

18、在另一优选例中，所述的重组载体为质粒。

19、在另一优选例中，所述的重组载体为puc57-vv质粒。

20、在另一优选例中，所述il33编码核酸插入溶瘤病毒f3l区。

21、在另一优选例中，所述痘苗病毒的f3l区基因全部或部分缺失。

22、在本发明的第三方面，提供了一种f3l缺陷型痘苗病毒，所述的f3l缺陷型痘苗病毒的功能性痘苗生长因子f3l区基因全部或部分缺失。

23、在另一优选例中，所述的f3l缺陷型痘苗病毒的f3l区基因相对于野生型缺失至少30％，优选至少50％，更优选至少80％。

24、在另一优选例中，所述的痘苗病毒选自下组：痘苗病毒copenhagen株、痘苗病毒western reserve株、痘苗病毒lister株、痘苗病毒wyeth株或痘苗病毒天坛株。

25、在另一优选例中，所述的f3l缺陷型痘苗病毒表达白介素33(il33)。

26、在另一优选例中，所述的il33为人或小鼠的il33。

27、在另一优选例中，编码所述人il33的dna序列如seq id no:1所示。

28、在另一优选例中，编码所述小鼠il33的dna序列如seq id no:2所示。

29、在另一优选例中，所述痘苗病毒含有外源的人或小鼠的il33基因。

30、在另一优选例中，所述痘苗病毒包含功能性f2l和/或f4l基因。

31、在本发明的第四方面，提供了一种活性成分组合，所述的活性成分组合包括：

32、(m1)第一活性成分，所述第一活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重组溶瘤病毒、如本发明第三方面所述的f3l缺陷型痘苗病毒、或其组合；和

33、(m2)第二活性成分，所述第二活性成分为免疫检查点抑制剂。

34、在另一优选例中，所述的免疫检查点抑制剂为特异性结合所述免疫检查点蛋白的抗体或其片段，优选为单克隆抗体、人源化抗体、全人源抗体、或其融合蛋白、或其组合。

35、在另一优选例中，所述的免疫检查点抑制剂抑制选自下组的免疫检查点蛋白：细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla4)、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、pd-l1、pd-l2、b7-h3、b7-h4、疮疹病毒侵入介体(hvem)、t细胞膜蛋白3(tim3)、半乳糖凝集素9(gal9)、淋巴细胞活化基因3(lag3)、含v结构域免疫球蛋白(ig)的t细胞活化抑制剂(vista)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)、b和t淋巴细胞衰减子(btla)、具有ig和π′iμ结构域的t细胞免疫受体(tigit)、吲哚胺2,3-二加氧酶(ido)或其组合。

36、在另一优选例中，所述免疫检查点抑制剂为特异性结合pd-1或pd-l1的单克隆抗体。

37、在另一优选例中，所述免疫检查点抑制剂选自下组：bms-936559、阿特朱单抗、度伐单抗(durvalumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、纳武单抗、派姆单抗(pembrolizumab)、兰洛利珠单抗(lambrolizumab)、或其组合。

38、在另一优选例中，所述免疫检查点抑制剂为特异性结合ctla4的单克隆抗体。

39、在另一优选例中，所述免疫检查点抑制剂选自下组：伊匹单抗(ipilimumab)、替西木单抗(tremelimumab)、或其组合。

40、在另一优选例中，所述的第二活性成分包括一种或多种免疫检查点抑制剂。

41、在另一优选例中，所述的活性成分组合包括：

42、(a)ctla4抑制剂、pd-1抑制剂和所述第一活性成分；

43、(b)ctla4抑制剂、ido抑制剂和所述第一活性成分；

44、(c)pd-1抑制剂、ido抑制剂和所述第一活性成分；

45、(d)pd-1抑制剂、ctla4抑制剂、ido抑制剂和所述第一活性成分；

46、(e)lag3抑制剂、pd-1抑制剂和所述第一活性成分；或

47、(f)tigit抑制剂、pd-1抑制剂和所述第一活性成分。

48、在本发明的第五方面，提供了如本发明第一方面所述的重组溶瘤病毒、如本发明第三方面所述的f3l缺陷型痘苗病毒、或如本发明第四方面所述的活性成分组合在制备用于治疗肿瘤的药物组合物或药盒中的用途。

49、在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：膀胱癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌和骨肉瘤。

50、在另一优选例中，所述的肿瘤包括转移性肿瘤和非转移性肿瘤。

51、在另一优选例中，所述的肿瘤为腹腔转移性膀胱癌。

52、在另一优选例中，所述的肿瘤不表达免疫检查点蛋白或以相对较低水平表达免疫检查点蛋白。

53、在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：

54、(1)治疗有效量的如本发明第一方面所述的重组溶瘤病毒、或如本发明第三方面所述的f3l缺陷型痘苗病毒、或如本发明第四方面所述的活性成分组合、或其组合；和

55、(2)药学上可接受的载体。

56、在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

57、在本发明的第七方面，提供了一种药盒，所述的，所述药盒包含：

58、(a)第一制剂，所述第一制剂含有治疗有效量的如本发明第一方面所述的重组溶瘤病毒和药学上可接受的载体、或如本发明第三方面所述的f3l缺陷型痘苗病毒、或其组合；和

59、(b)第二制剂，所述第二制剂含有免疫检查点抑制剂。

60、在另一优选例中，所述的药盒进一步包括说明书，所述说明书描述了将所述重组溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂联用以治疗肿瘤的方法。

61、在另一优选例中，所述的第一制剂和第二制剂是各自独立的。

62、在另一优选例中，所述的第一制剂和第二制剂分别为冻干制剂或液态制剂。

63、在另一优选例中，所述的第一制剂和第二制剂是注射剂。

64、在另一优选例中，所述的第一制剂在施用第二制剂之前、之中或之后被施用。

65、在另一优选例中，所述第一制剂的施用方式为瘤内注射。

66、在另一优选例中，所述第二制剂的施用方式为肿瘤内、静脉内或腹膜内注射。

67、在本发明的第八方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗肿瘤的方法，包括步骤：向有需要的受试者施用治疗有效量的如本发明第一方面所述的重组溶瘤病毒、或如本发明第三方面所述的f3l缺陷型痘苗病毒、或如本发明第四方面所述活性成分组合、或如本发明第六方面所述的药物组合物。

68、在另一优选例中，所述有需要的受试者为人类或非人类哺乳动物。

69、在另一优选例中，所述的非人类哺乳动物包括猴、猩猩、牛、猪、狗、羊、兔或鼠。

70、在另一优选例中，所述有需要的对象为小鼠或人。

71、在另一优选例中，所述的施用为肿瘤内、静脉内或腹膜内施用。

72、在另一优选例中，所述的重组溶瘤病毒在肿瘤内施用。

73、在另一优选例中，所述的重组溶瘤病毒以有效诱导所述肿瘤中免疫检查点蛋白表达的量施用。

74、在另一优选例中，在施用所述重组溶瘤病毒之前，所述肿瘤不表达所述免疫检查点蛋白或以相对较低水平表达所述免疫检查点蛋白。

75、在另一优选例中，将多种免疫检查点抑制剂与所述重组溶瘤病毒同时施用于所述受试者。

76、在另一优选例中，所述重组溶瘤病毒以约104至约109pfu，优选约107pfu的量施用。

77、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。