一种绛红色小单孢菌原生质体ARTP诱变及融合筛选高产菌株的方法与流程

本发明具体涉及一种绛红色小单孢菌原生质体artp诱变及融合筛选高产菌株的方法，属于医药生物。

背景技术：

1、庆大霉素是由weinstein于1963年首次从绛红小单孢菌和棘孢小单孢菌中分离所得，是一种氨基糖苷类广谱抗生素；庆大霉素是一种多组份抗生素，根据其分子结构的差异可分为c组分（c1、c1a、c2、c2a等）和a（a、b、x等）；庆大霉素具有抗菌范围广、抑菌效果好、杀菌时间短、价格低廉等优点而被广泛应用，但也存在着产量低、发酵时间长、产品杂质高等缺点；目前为了提高庆大霉素发酵单位，主要是从改变菌株的遗传性状出发；绛红小单孢菌是gm的产生菌之一，具有遗传性质十分稳定，不易被改变，对诱变因素抗性大等特点，传统的诱变方法较难得到高产菌株；近年来，对绛红小单孢菌的筛选主要集中在进行紫外诱变，现有技术中，使用紫外诱变和化学诱变的方法得到的突变株较原始菌株有所提高，但都提高不大；等离子体（artp）是一种近年来发展起来的诱变方法，artp通过射频辉光放电能产生各种高能活性离子，这些离子能改变细菌细胞壁和细胞膜的通透性，损伤到细菌的遗传物质，从而引起菌株突变，具有安全性高、操作简便、正突变率高、稳定性好等优点；在频繁的试验中发现，对原生质体进行artp处理更易于突变，但是这种处理不能聚集多个菌株的优良性状。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提出了一种绛红色小单孢菌原生质体artp诱变及融合筛选高产菌株的方法，对所得到的突变融合菌株进行鉴定，并对其生长特性的跟踪观察，经过多次的考察筛选，筛选出高性能菌株，提高庆大霉素的产量。

2、本发明的绛红色小单孢菌原生质体artp诱变及融合筛选高产菌株的方法，所述方法如下：

3、a、孢子菌获取，取一支生长丰满并培养成熟的孢子斜面，挖取1cm2的孢子块接种至种瓶培养基中，培养2d，获取生长对数期菌悬液；

4、b、原生质体悬液制备，将上一步获取的生长对数期菌悬液在离心机中采用3000r/min离心15min得到菌体，加p稳定液洗涤3~5次并除去杂质，加入终浓度为2.5mg/ml的溶菌酶进行酶解90~120min，此过程前三次间隔20min镜检一次，接着每隔10min镜检一次，镜检取样采用压滴法制片进行镜检原生质体形成情况，当镜检超过80~90%菌体脱去细胞壁，呈现单一的原生质体球时，停止酶解反应，用装有脱脂棉的过滤装置过滤，滤液转在离心管中，并在1500r/min条件下离心15min，加p稳定液洗涤3~5次，得到原生质体悬液；

5、c、对原生质体进行artp诱变处理，将上一步得到的原生质体悬液用移液枪吸取20μl原生质体悬液置于artp诱变样品器中进行诱变，调节诱变参数为诱变高度2mm、气体流量12slm，诱变时间设置为40s，完成诱变；

6、d、融合子制备，将上一步得到的原生质体悬液计算原生质体浓度，每毫升原生质体数=[（a1+a2+a3+a4+a5）/80]×4000000×稀释倍数，按照1:1混合，1500r/min离心15min，弃上清，加入融合剂40%peg40002ml，融合30min，此过程经过轻混和镜检，原生质体融合结束，融合结束加p稳定液洗涤3~5次，1500r/min，离心15min，得到融合子；

7、e、单菌落制备，将上一步得到的融合子用p稳定液按照正常分离逐步稀释10-3、10-4、10-5和10-6，分别取100μl融合子涂在分离固体培养基的平板上，在条件为35.5±1℃和湿度45~65%下培养10~12d，得到单菌落；

8、f、单菌落挑选和培养，将上一步得到的单菌落，通过目视挑选单菌落，用灭菌的牙签挑取单菌落，接种于24孔的种孔板培养基中，在条件为35.5±1℃、220r/min条件下，培养42h；

9、g、菌落由种孔板接孔发酵孔板和斜面孔板，从上一步的种孔板吸取600μl接于24孔发酵孔板中，35.5±1℃、220r/min，培养3~4d；再吸取100μl接于斜面孔板中，35.5±1℃、湿度45-65%下培养10d；

10、h、发酵孔板培养，经过上一步的发酵孔板培养完成后，使用20%硫酸酸化发酵液至ph1.5~2.0，混合后静置20min，3000r/min，离心20min，再吸取20μl酸化后的发酵液置于96孔板中，加入160μl的opa衍生试剂、820μl的ddh2o，并在60℃水浴15min，之后吸取200μl衍生后的发酵液加入96孔板中，其中，96孔板外沿一圈不加检测样品，加ddh2o代替样品，酶标仪检测吸光度，震荡5s，设置检测波长为325nm；

11、i、斜面孔板培养，经过酶标仪检测筛选得到数据较高的菌株，从斜面孔板传茄瓶斜面，在35.5±1℃、湿度45-65%下培养10d；挖取1.0cm2孢子接入种子瓶中，35.5℃±1，220r/min下培养42h，在超净工作台中吸取10ml菌丝种子，接入发酵摇瓶，35.5±1℃，220r/min，培养96h；

12、j、对茄瓶斜面孢子进行一级和二级摇瓶考察，将上一步发酵摇瓶中的发酵液酸化至ph1.5~2.0，混匀静置20min，过滤取上清液，衍生化步骤与发酵孔板培养步骤一致，并采用高效液相色谱仪检测效价及组份；液相条件：色谱柱为agilentzorbaxsb-c18，柱温为30℃，流动相为甲醇：水相：乙酸=710:240:50（v/v/v），流速1.5ml/min，检测波长为330nm；对筛选出来的高产菌株连续传代培养，在超净工作台里用2#棒轻刮取孢子，接种于3支空白斜面培养基中，并在35.5±1℃和湿度45-65%条件下培养10d，培养成熟后，挖取1.0cm2孢子接入种子瓶中，培养42h，接发酵摇瓶，培养条件与斜面孔板培养步骤一致，使用高效液相色谱的方法检测发酵液效价和各组份，重复上述工作4次。

13、目标菌株为分类命名为绛红色小单孢菌（micromonospora purpurea），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2023年06月28日，保藏号为cgmcc no.27731；目标菌株为存活菌株。

14、进一步地，所述种瓶培养基配比为：配制1000ml培养基，添加可溶性淀粉6.25g、蛋白胨5g、玉米粉15g、黄豆饼粉18.8g、葡萄糖1g、硝酸钾0.6g、浓度为1.2μg/ml的氯化钴0.24ml和碳酸钙6.25g，调节ph至7.0，121℃高压蒸汽灭菌30min；所述p稳定液配比为：配制160ml溶液，添加蔗糖20.6g，k2so4 0.05g和mgcl2.6h2o 0.4g；所述溶菌酶溶液配比为：配制10ml溶液，称取溶菌酶0.1g，添加p稳定液溶解，定容至10ml；使用时，溶菌酶溶液与菌液按照1:3的配比加入，终浓度为2.5mg/ml。

15、进一步地，所述分离固体培养基配比为：配制1000ml培养基、琼脂条12g、可溶性淀粉7.5g、天冬碱0.02g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.5g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.3g和碳酸钙1g，调节ph至7.5，121℃高压蒸汽灭菌25min。

16、进一步地，所述种孔板培养基配比与种瓶培养基配比一致，每孔加3ml。

17、进一步地，所述发酵孔板的培养基配比为：配制1000ml培养基，添加玉米淀粉37g、蛋白胨4g、，玉米粉11.5g、黄豆饼粉35g、葡萄糖2g、硝酸钾0.185g、硫酸铵1g、浓度为10μg/ml的氯化钴2ml和碳酸钙3g，调节ph至7.0，121℃高压蒸汽灭菌30min。每孔加3ml。所述斜面孔板的培养基配比为：配制1000ml培养基，添加麸皮12g、琼脂粉13g、可溶性淀粉7.5g、天冬碱0.02g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.5g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.3g和碳酸钙1g，调节gh至7.5，121℃，高压蒸汽灭菌25min；每孔加3ml。

18、进一步地，所述opa衍生试剂配制过程如下：称取2.5g opa加入12.5ml甲醇中溶解，加入237.5ml 浓度为0.4mol/l硼酸和5ml巯基乙酸，使用45%氢氧化钠溶液调节ph至10.4；所述45%氢氧化钠溶液配制过程为：称取90g氢氧化钠，加入110ml ddh2o中溶解；0.4mol/l硼酸配制过程为：称取6.183g硼酸，加入100ml ddh2o中溶解，定容至250ml，使用45%氢氧化钠溶液调pph至10.4。

19、进一步地，所述茄瓶斜面的配比为：配制1000ml培养基，添加琼脂条12g、麸皮12g、可溶性淀粉7.5g、天冬碱0.02g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.5g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.3g和碳酸钙1g，调节gh至7.5，121℃高压蒸汽灭菌25min；所述发酵瓶的培养基的配比与发酵孔板的培养基配比一致。

20、进一步地，所述水相配比为：庚烷磺酸钠5.5g，用纯化水定容至240ml 。

21、与现有技术相比，本发明的绛红色小单孢菌原生质体artp诱变及融合筛选高产菌株的方法，对绛红色小单孢菌原生质体制备的过程、artp诱变和原生质体融合配合，将单一的选育方法融合在一起进行菌种筛选，提高了菌种筛选的进度，优化了菌种的产量和质量，复合处理筛选出来的菌种聚集多个菌株的优点，符合生产要求。