一株台中类芽孢杆菌及其应用

本发明属于微生物发酵。更具体地，涉及一株台中类芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

1、陈皮(pericarpium citri reticulatae)由芸香科柑橘属橘(citrus reticulatablanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮炮制而成，是我国传统的药食两用药材。陈皮“陈久者良”意思是陈化年限越久，陈皮药用功效越显著，其又有“陈皮”和“广陈皮”之分，在于广陈皮主要来源于柑橘的变种茶枝柑(citrus reticulata‘chachiensis’)。而在陈皮的陈化过程中微生物代谢活跃，使其药效成分含量显著增加。现有代谢组学分析的结果表明，广陈皮中除了橙皮苷、川陈皮素、橘皮素这三种药典中所规定的黄酮外，实际上广陈皮中所含黄酮多达219种。广陈皮中的黄酮可以划分为黄酮苷、黄酮苷元和多甲氧基黄酮三类，基于kegg代谢网络途径分析，黄酮苷可以通过酶水解去掉2个糖苷分子获得芹菜素、木犀草素等黄酮苷元，而黄酮苷元可以经过甲基转移酶催化形成去甲基川陈皮素等多甲氧基黄酮。其中，去甲基川陈皮素是一种多甲氧基黄酮(pmfs，polymethoxylated flavones)，pmfs正是广陈皮中最重要的药效成分之一。大量研究表明，pmfs具有广泛的生物学活性，在抗氧化、抗癌、抗肥胖和抗炎等方面活性十分显著；而木犀草素具有镇咳和祛痰作用，具有消炎、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等多种药理活性，临床主要用于止咳、祛痰、治疗心血管疾病等；芹菜素则具有保护神经、抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化等多种生物活性等等。这些具有不同生物活性的多种黄酮类化合物共同构成了广陈皮独特的药用功效。

2、现今广陈皮陈化工序以自然陈化为主，即储存在通风良好的陈化仓中自然陈化三到五年，陈化时间过长，不利于提高陈皮产量，且自然储藏环境复杂不可控制，难以实现标准化，而且还易造成广陈皮的霉变腐烂或虫蛀。为了缓解广陈皮供求紧张的现状、标准化广陈皮品质和简化陈化工序具有重要意义。又因为在不同陈化年份的广陈皮上蕴含着丰富的微生物类群，与广陈皮中丰富的黄酮类化合物的积累密切相关。现有研究利用微生物发酵加速陈皮药效成分的积累，如现有技术公开采用真菌卷枝毛霉(mucor circinelloides)能够促进陈皮的陈化，提高陈皮中有效物质含量。由于不同种类的微生物在调节广陈皮上不同种类的黄酮类化合物所发挥的功能特性不同，这为定向生产稳定且高质量的陈皮提供了可能。

3、但目前可应用于微生物发酵提高陈皮中黄酮类化合物的菌种资源较少，需要开发更多的菌种资源，来加速陈皮的陈化以及有效成分的积累，还能够定向生产稳定、优质且具有不同功能特性的新型陈皮。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有陈皮发酵菌种的不足，提供一株台中类芽孢杆菌及其应用。

2、本发明的目的是提供一株台中类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)r12菌株及其应用。

3、本发明另一目的是提供一种提高陈皮中黄酮类化合物含量的制剂

4、本发明又一目的是提供一种促进陈皮中有效物质黄酮类化合物累积的方法。

5、本发明再一目的是提供一种缩短陈皮陈化时间的方法。

6、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

7、本发明从广陈皮中分离鉴定得到一株台中类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)r12菌株，该菌株已于2023年11月23日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno:64060。将该菌株用于陈皮陈化发酵能提高广陈皮中木犀草素、芹菜素和去甲基川陈皮素的含量，利于主要药效成分的积累，其效果优于自然陈化1年的陈皮；同时，本发明提供一种缩短陈皮陈化时间的方法，采用r12菌株用于陈皮陈化能够定向生产稳定、优质且具有高黄酮类化合物含量的新型陈皮，不仅能加速陈皮陈化，缩短陈化时间，还丰富了陈皮微生物陈化的菌种资源，提高了陈化效率，为缩短陈皮陈化时间提供了更多的方法途径。

8、本发明提供台中类芽孢杆菌r12菌株或其菌液在陈皮陈化中、在缩短陈皮陈化时间或在制备加快陈皮陈化产品、在促进陈皮中有效物质黄酮类化合物累积、或在制备促进陈皮中有效物质黄酮类化合物累积的制剂中的应用。

9、优选地，所述陈皮中黄酮类化合物为木犀草素、芹菜素和去甲川陈皮素中的一种或多种。

10、优选地，所述陈皮为广陈皮。

11、本发明提供一种提高陈皮中黄酮类化合物含量的制剂，含台中类芽孢杆菌r12菌株或其菌液。

12、本发明提供一种促进陈皮中有效物质黄酮类化合物累积的方法，采用台中类芽孢杆菌r12菌株或其菌液对陈皮原料进行处理。

13、本发明还提供一种缩短陈皮陈化时间的方法，采用台中类芽孢杆菌r12菌株或其菌液对陈皮进行发酵处理。

14、优选地，以2～4％的重量比将台中类芽孢杆菌r12菌株或其菌液接种至陈皮中进行发酵处理。特别地，将台中类芽孢杆菌r12菌株活化后传代培养至2代后扩大培养再接种；采用2代菌种具有较高的生物活性，而且能够良好的维持菌株原有的功能，变异率较低等优点。

15、更优选地，所述发酵处理的条件为：发酵温度25～28℃，湿度70％～80％，发酵时间不低于90天。

16、进一步优选地，所述陈皮采用茶枝柑新皮。

17、作为一种具体的实施方案，本发明提供缩短陈皮陈化时间的具体方法：

18、(1)选料：取成色好，无明显病虫害的茶枝柑，将茶枝柑洗净剥皮后自然干燥至水分含量低于13％，即可获得茶枝柑新皮，置于室温、湿度45％下保存备用；

19、(2)原料前处理：将自然干燥的茶枝柑新皮60℃干燥30分钟后，粉碎成细粉(制备不同陈化产品时可调节，不粉碎)，过60目筛，混合均匀；

20、(3)菌种活化：将-80℃保藏的菌种用nb培养基进行复苏培养，确认菌种纯度和活性后，再经过传代培养至2代；

21、(4)菌种制备：将活化后的菌株接种到nb培养基中，30℃摇床扩大培养2～3天，离心去除培养液，收集沉淀，以无菌的去离子水清洗2～3遍，去除液体，即可获得新鲜菌种；

22、(5)接种及发酵：将菌种以2～4％的重量比接种至茶枝柑新皮粉中，搅拌混匀，然后置于无菌容器中发酵，发酵温度为25～28℃，湿度70％～80％，发酵时间不低于90天(调节发酵时间可制备不同年分的陈皮)；

23、(6)发酵后处理：发酵结束后将茶枝柑皮粉35℃干燥24小时即可获得成品。

24、本发明具有以下有益效果：

25、本发明从广陈皮中分离鉴定得到一株台中类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)r12菌株，该菌株已于2023年11月23日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno:64060。将该菌株用于陈皮陈化发酵能提高广陈皮中木犀草素、芹菜素和去甲基川陈皮素的含量，利于主要药效成分的积累，其效果优于自然陈化1年的陈皮；同时，本发明提供一种缩短陈皮陈化时间的方法，采用r12菌株用于陈皮陈化能够定向生产稳定、优质且具有高黄酮类化合物含量的新型陈皮，不仅能加速陈皮陈化，缩短陈化时间，还丰富了陈皮微生物陈化的菌种资源，提高了陈化效率，为缩短广陈皮陈化时间提供了更多的方法途径。