一种激活Wnt信号通路的RNA编辑系统

本申请涉及基因编辑领域，特别涉及一种激活wnt信号通路的rna编辑系统。

背景技术：

1、crispr系统是在细菌中发现的一种获得性免疫防御机制，其中cas13蛋白特异性靶向rna。2018年3月，salk研究所的konermann以及arbor biotechnologies公司的yan等人分别从不同菌种中分离出一种新的cas13蛋白，称为cas13d。cas13d通过与grna协同作用发挥功能。grna由两部分组成，可转录成特异性识别靶基因的spacer序列(长度约为30nt)和用于结合cas13d蛋白的dr序列。当spacer序列通过碱基互补配对的方式识别目标rna后，cas13d蛋白被招募到特定位置，发挥切割活性，使得rna被降解。因为cas13d体积更小，仅约930个氨基酸，因此更容易由病毒载体递送。2020年，周海波等人利用cas13d特异性地敲低视网膜穆勒胶质细胞中ptbp1基因表达，并且利用aav载体在成体中实现视神经节细胞再生，证实cas13d具有体内rna编辑的可行性。

2、另一方面，以肺组织为例，肺泡是发生气体交换的重要场所，但由于与外界环境密切接触容易发生损伤。肺泡具有两种上皮细胞，分别是i型肺泡上皮细胞(type i alveolarepithelial cells)和ii型肺泡上皮细胞(type ii alveolar epithelial cells)，前者负责气体交换，而后者通过分泌表面活性剂以减小肺泡表面张力。正常状态下，肺是高度静息的组织，但已有研究表明，在肺各个区域存在不同的上皮干/祖细胞，这些细胞在肺损伤后可以快速响应，通过增殖分化参与气管和肺泡的损伤修复。这些干/祖细胞包括位于肺泡中的ii型肺泡上皮细胞，具有分化为i型肺泡上皮细胞的潜能；位于气管的基底细胞(basalcells)，可分化产生各类气道上皮细胞；气道上的club细胞，可分化产生纤毛细胞；支气管肺泡连接处的bronchioalveolar stem cells(bascs)，可分化产生肺泡和气道上皮细胞；位于远端气道的干/祖细胞，被称为谱系阴性上皮干/祖细胞(lineage negativeepithelial progenitors,lneps)，具有向ii型肺泡上皮细胞和基底样细胞分化的潜能；另外，肺泡中的ii型肺泡上皮细胞(at2s)，具有分化为i型肺泡上皮细胞(at1s)的潜能。

3、这些上皮干/祖细胞的分化命运与其所处的微环境息息相关，其中wnt/β-catenin信号通路参与了干/组细胞的增殖和分化。在流感模型中，激活lneps的wnt/β-catenin信号通路可以促进其向at2方向分化；另外，wnt/β-catenin信号通路维持了at2的干细胞活性，促进at2的增殖，已有研究通过开发frizzled5的特异性抗体，激活at2细胞的wnt/β-catenin活性，在类器官系统和博莱霉素损伤的小鼠模型中均可看到促进at2细胞的增殖。

4、wnt信号通路是生物体中高度保守的信号转导通路，在细胞增殖、分化、迁移中发挥功能。已有研究表明，wnt信号通路的激活在不同的组织再生中发挥作用，比如促进肝脏损伤修复和皮肤表皮层的更新。但在成体中如何安全有效的激活wnt信号通路是尚未解决的问题，传统的小分子抑制剂比如chir99021和licl可以通过抑制gsk3β的活性激活wnt信号通路，但小分子抑制剂无法作用于特定组织或细胞，其安全性和药物有效性得不到保障。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，为解决现有技术中wnt信号通路不能安全有效地激活这一技术问题，本申请的目的在于提供一种激活wnt信号通路的rna编辑系统，基于cas13蛋白casrx的rna编辑，相较于dna编辑，只改变rna水平，不会改变dna序列，由于rna在细胞内有很多拷贝并且不断更新，因此这是一种瞬时性的调控方式，安全性更好。本申请选择cas13d，并设计了特异性靶向β-catenin降解复合物成员axin1和axin2的grna序列，通过瞬时的下调axin1和axin2 mrna水平的表达，稳定β-catenin，激活wnt信号通路。另一方面，本申请还选择aav载体递送编辑元件，通过筛选不同的aav血清型，筛选出了对特定细胞具有最优感染效率的aav血清型。将编辑元件包装入aav载体进一步递送至成体内，最终实现对特定细胞进行安全有效的mrna水平的调控，进而激活wnt信号通路。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本申请第一方面提供一种rna编辑元件，包括靶向axin1的rna片段及靶向axin2的rna片段。

3、本申请第二方面提供一种生物材料，选自以下任一：

4、1)生物材料为一种多核苷酸，多核苷酸编码前述的rna编辑元件；

5、2)生物材料为一种核酸构建体，核酸构建体含有1)的多核苷酸；

6、3)生物材料为一种宿主细胞，宿主细胞包括2)的构建体或基因组中整合有1)的多核苷酸。

7、本申请第三方面提供一种基因编辑系统，包括：如前述的rna编辑元件或其编码基因；以及，核酸酶或其编码基因，或所述的rna编辑元件和核酸酶的复合物。

8、本申请第四方面提供一种药物组合物，药物组合物包括前述的基因编辑系统，以及药学上可接受的载体。

9、本申请第五方面提供前述的rna编辑元件、前述的生物材料、前述的基因编辑系统或前述的药物组合物在制备具有以下任一项或多项功能的产品中的用途：

10、a)激活wnt通路；

11、b)治疗肺损伤相关疾病；

12、c)促进肺再生；

13、d)促进ii型肺泡上皮细胞的增殖和分化。

14、本申请第六方面提供一种基因编辑方法，将前述的基因编辑系统与axin1和axin2基因接触，以实现axin1和axin2基因的编辑。

15、本申请第七方面提供一种细胞，通过前述的基因编辑方法进行基因编辑获得；优选地，所述细胞为哺乳动物细胞；更优选地，所述细胞为肺上皮干细胞。

16、与现有技术相比，本申请的有益效果为：

17、1、本发明构建同时靶向axin1和axin2的grna，比单独靶向axin1或axin2的grna能够显著上调wnt活性。

18、2、本发明在三种不同血清型的aav载体中筛选得到aav6载体，表达强度和感染效率比较高，且对气道上皮细胞和肺泡上皮细胞的感染效率高，而对免疫细胞和内皮细胞感染效率很低。

19、3、aav载体通过与cre-loxp重组酶系统组装，共同感染宿主细胞，便于通过荧光标记检测cas13d的敲入效率。

技术特征：

1.一种rna编辑元件，其特征在于，所述rna编辑元件包括靶向axin1的rna片段及靶向axin2的rna片段。

2.如权利要求1所述的rna编辑元件，其特征在于，所述rna编辑元件包括靶向axin1exon区域的rna片段及靶向axin2exon区域的rna片段；优选地，所述axin1exon区域选自axin1的exon2、exon6、exon9或exon10，所述axin2exon区域选自axin2的exon2、exon6、exon10或exon11；更优选地，所述axin1exon区域选自axin1的exon9，所述axin2exon区域选自axin2的exon10。

3.如权利要求1所述的rna编辑元件，其特征在于，所述靶向axin1的rna片段的spacer的编码基因包括seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seqid no：6、seqid no：7、seq id no：8、seq id no：10、seq id no：11、seq id no：12、seq id no：13、seqid no：14、seq id no：15或seq id no：16所示的序列；所述靶向axin2的rna片段的spacer的编码基因包括seq id no：17、seq id no：18、seq id no：19、seq id no：20或seq id no：21所示序列；优选的，所述靶向axin1的rna片段的spacer的编码基因包括seq id no：14所示的序列，所述靶向axin2的rna片段的spacer的编码基因包括seq id no：19所示的序列；

4.如权利要求1所述的rna编辑元件，其特征在于，所述靶向axin1的rna片段的编码基因包括如seq id no：22、seq id no：23、seq id no：24、seq id no：25、seqid no：26、seqid no：27、seq id no：28、seq id no：29、seq id no：30、seqid no：31、seq id no：32、seqid no：33、seq id no：34、seq id no：35或seqid no：36所示的序列，所述靶向axin2的rna片段的编码基因包括如seq id no：37、seq id no：38、seq id no：39、seq id no：40或seqid no：41所示的序列；优选地，所述靶向axin1的rna片段的编码基因包括seq id no：34所示序列，所述靶向axin2的rna片段的编码基因包括seq id no：39所示序列。

5.如权利要求1所述的rna编辑元件，其特征在于，所述rna编辑元件的编码基因包括如seq id no：42所示的序列。

6.一种生物材料，选自以下任一：

7.一种基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括：如权利要求1～5任一权利要求所述的rna编辑元件或其编码基因；以及，核酸酶或其编码基因，或如权利要求1～5任一权利要求所述的rna编辑元件和核酸酶的复合物。

8.如权利要求7所述的基因编辑系统，其特征在于，所述核酸酶是crispr核酸酶；优选地，所述核酸酶选自cas9、cas12、cas13蛋白家族或其变体；进一步优选地，所述核酸酶选自cas13d。

9.如权利要求7所述的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统还包括载体，所述载体包括权利要求1～5任一权利要求所述的rna编辑元件编码基因，和/或，核酸酶编码基因；

10.如权利要求9所述的基因编辑系统，其特征在于，所述载体为aav载体；优选地，所述aav载体选自aav5、aav6或aav9血清型载体。

11.如权利要求10所述的基因编辑系统，其特征在于，所述aav载体包括调控元件；优选地，所述调控元件包括顺式作用元件和启动子；优选地，所述顺式作用元件包括反向末端重复序列；所述启动子包括cmv、pgk、cag、ef1α、afp、u6中的一种或多种；更优选地，调控所述核酸酶表达的启动子为cmv，调控所述的rna编辑元件的启动子为u6。

12.如权利要求10所述的基因编辑系统，其特征在于，还包括：

13.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求7～12任一项所述的基因编辑系统，以及药学上可接受的载体。

14.如权利要求1～5任一所述的rna编辑元件、如权利要求6所述的生物材料、如权利要求7～12任一项所述的基因编辑系统或权利要求13所述的药物组合物在制备具有以下任一项或多项功能的产品中的用途：

15.一种基因编辑方法，其特征在于，将如权利要求7～12任一项所述的基因编辑系统与axin1和axin2基因接触，以实现axin1和axin2基因的编辑。

16.一种细胞，通过如权利要求15所述的基因编辑方法进行基因编辑获得；优选地，所述细胞为哺乳动物细胞；更优选地，所述细胞为肺上皮干细胞。

技术总结本申请涉及基因编辑领域，特别涉及一种激活Wnt信号通路的RNA编辑系统。本申请提供一种RNA编辑元件，包括靶向Axin1的RNA片段及靶向Axin2的RNA片段。本发明构建同时靶向Axin1和Axin2的gRNA，比单独靶向Axin1或Axin2的gRNA能够显著上调Wnt活性。本发明在三种不同血清型的AAV载体中筛选得到AAV6载体，表达强度和效率比较高，且对气道上皮细胞和肺泡上皮细胞的感染效率高，而对免疫细胞和内皮细胞感染效率很低。AAV载体通过与Cre‑LoxP重组酶系统组装，共同感染宿主细胞，便于通过荧光标记检测Cas13d的敲低效率。技术研发人员：席莹,沈晟晞受保护的技术使用者：上海科技大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18