CO2活化关键酶及其应用

本发明属于酶的定向进化改造和生物催化应用，涉及co2活化关键甲醛脱氢酶及其应用。

背景技术：

1、多酶级联反应利用甲酸脱氢酶fdh/甲醛脱氢酶falddh/甲醇脱氢酶adh将co2在温和条件下一步转化为甲醇是一种非常重要的环境友好型洁净能源生产过程。该反应通过逆转生物代谢途径来实现，其中使用甲醛脱氢酶falddh的中间步骤是瓶颈反应。目前利用来源于假单胞菌属的商品甲醛脱氢酶(ec1.2.1.46,150kda)还原甲酸为甲醛以转化co2合成甲醇的效率非常低，反应几个小时产生的甲醇浓度<1mm。在这一多酶级联反应过程中，尽管甲酸脱氢酶催化co2→甲酸的速率很慢(km＝30-50mm，vmax＝0.002mm/min)，但第二步由甲醛脱氢酶催化甲酸→甲醛的速率(甲酸浓度<0.1-2.5mm，没有明显反应；甲酸浓度>5.0mm，ph值明显下降导致甲醛脱氢酶falddh和辅酶nadh不稳定)远低于甲醛→甲酸的速率(km＝0.06mm，vmax＝0.01mm/min)(new biotechnol.,2015,32,319-327)。因此，甲醛脱氢酶falddh的低还原活性和稳定性是co2定向高效转化为甲醇反应的主要挑战。

2、目前，通过多酶级联反应将co2转化为甲醇途径关键酶的报道几乎集中在甲酸脱氢酶上，少有报道甲醛脱氢酶。专利cn101386862a和cn114621935a公开的来源于恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)甲醛脱氢酶基因、编码蛋白和重组载体以及通过对其定向进化筛选得到突变体，主要应用于甲醛→甲酸过程中对nad类似物还原效率的提升。专利zl102337280b和zl104109679b提供的短芽孢杆菌和吊兰甲醛脱氢酶基因核苷酸序列和编码的蛋白质氨基酸序列，提高了植物对甲醛吸收、代谢和耐受能力，主要应用于甲醛净化植物的培育。对于应用于co2多酶级联反应过程催化甲酸→甲醛的甲醛脱氢酶falddh，singh等首次报道了新型甲醛脱氢酶bmfalddh(burkholderia multivorans，km＝1.70mm，kmax/km＝0.38mm-1·min-1)，克服了商品甲醛脱氢酶ppfalddh的低还原活性限制，多酶级联反应转化co2产生1.69mm甲醇，提高甲醇产率126倍，证实了高效甲醛脱氢酶falddh在将co2还原为甲醇的级联反应中起到关键作用(acs catal.,2018,8,11085-11093)。

3、另外，底物甲酸浓度和ph值间“trade-off”效应导致的甲醛脱氢酶falddh结构不稳定性也是co2高效转化途径一直以来需要解决而尚未解决的难题。因此，非常有必要利用生物大数据开发高还原活性、高底物/产物和ph稳定性的甲醛脱氢酶falddh，结合现有的先进技术和开发新的技术，利用合成代谢的优势，弥补当前商品酶匮乏问题，将高效甲醛脱氢酶falddh应用于co2多酶级联转化反应过程。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对多酶级联反应转化co2合成甲醇途径甲醛脱氢酶还原活性低、底物/产物和ph稳定性差等，提供了具有高效催化甲酸合成甲醛功能的酶，所述甲醛脱氢酶均具有较高的酶活性和催化强度，可以快速合成大量的甲醛，为co2高效活化转化合成甲醛，并进一步定向转化为高值化学品的生物化学途径提供了新动力。

2、为此，本发明第一方面提供了co2活化关键酶，包括甲醛脱氢酶aqfalddh、甲醛脱氢酶szfalddh、甲醛脱氢酶ppfalddh和甲醛脱氢酶chfalddh中的一种或几种。

3、所述甲醛脱氢酶aqfalddh、甲醛脱氢酶szfalddh、甲醛脱氢酶ppfalddh和甲醛脱氢酶chfalddh分别来源于产水菌aquitalea sp.usm4、链霉菌streptomyceszinciresistens、耐冷假单胞菌pseudomonas psychrotolerans和色素杆菌chromobacterium haemolyticum。

4、根据本发明的一些实施方式，所述甲醛脱氢酶falddh为以下所示蛋白质中的任一种：

5、(i)氨基酸序列为seq id no.1～4中任一项的蛋白质；

6、(ii)将seq id no.1～4任一项所示的氨基酸序列经一个或几个氨基酸残基的修饰和/或取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

7、(iii)与(i)或(ii)所限定的氨基酸序列具有≥75％同源性的氨基酸序列且具有相同功能的蛋白质；

8、(iv)在(i)-(iii)中任一种蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

9、所述的seq id no.1代表的甲醛脱氢酶命名为aqfalddh；seq id no.2代表的甲醛脱氢酶命名为szfalddh；seq id no.3代表的甲醛脱氢酶命名为ppfalddh；seq id no.4代表的甲醛脱氢酶命名为chfalddh。

10、本发明中，氨基酸序列如seq id no.1～4所示的甲醛脱氢酶均为野生甲醛脱氢酶，其基因来源于产水菌aquitalea sp.usm4、链霉菌streptomyces zinciresistens、耐冷假单胞菌pseudomonas psychrotolerans和色素杆菌chromobacterium haemolyticum，在不改变上述氨基酸序列的前提下，分别将其基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后甲醛脱氢酶aqfalddh、szfalddh、ppfalddh、chfalddh基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其核苷酸序列为seq id no.5～8，亦即，经密码子优化的编码氨基酸序列如seq id no.1～4所示的蛋白质(野生甲醛脱氢酶)基因的核苷酸序列分贝如seq id no.5～8所示。

11、本发明第二方面提供了编码发明第一方面所述甲醛脱氢酶的核苷酸，所述核苷酸具有(i)、(ii)、(iii)或(iv)所示的核苷酸序列中的任意一个：

12、(i)编码本发明第一方面所述的甲醛脱氢酶的核苷酸序列；

13、(ii)如seq id no.5～8任一项所示的核苷酸序列；

14、(iii)与(i)或(ii)中所述的核苷酸序列具有≥75％同一性，且编码本发明第一方面所述的甲醛脱氢酶的核苷酸序列；

15、(iv)在严格条件下与(i)或(ii)中所述的核苷酸序列杂交，且编码本发明第一方面所述的甲醛脱氢酶的核苷酸序列。

16、本发明第三方面提供了一种co2活化关键甲醛脱氢酶的基因表达载体及其构建方法、重组工程菌、纯化制备方法。

17、所述基因表达载体包括编码如本发明第一方面所述的甲醛脱氢酶的氨基酸序列或如第二方面所述的核苷酸。所述表达载体可以是大肠杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体。优选地，所述基因表达载体为pet质粒，优选为petduet质粒。同时为实现蛋白的可溶性表达，引入伴侣蛋白，主要是dnak(dnaj，grpe)和groel(groes)等，即在bl21(de3)中引入一个表达伴侣蛋白的表达质粒。优选地，所述分子伴侣质粒为pg-kje8、pgro7、pkje7、pg-tf2、ptf16等，优选为pgro7表达质粒。

18、所述基因表达载体的构建方法是通过将编码如第一方面所述的甲醛脱氢酶的氨基酸序列或如第二方面所述的核苷酸插入质粒的限制性酶切位点之间，得到所述基因表达载体。

19、所述构建方法还包括插入甲醛脱氢酶基因的操作。

20、示例性的，所述构建方法具体包括如下步骤：

21、将甲醛脱氢酶基因插入petduet质粒mcs1和mcs2多克隆位点中的限制性酶切位点之间，例如bamhi/saci、saci/hindⅲ、ncoi/saci、bglⅱ/pacⅰ等，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的所有限制性酶切位点的组合，构建质粒petduet-falddh。

22、所述产甲醛脱氢酶的重组工程菌包含如第三方面所述的基因表达载体和/或表达质粒和/或编码第二方面所述的甲醛脱氢酶的核苷酸。优选地，所述工程菌为e.coli bl21(de3)。

23、所述甲醛脱氢酶的纯化制备方法，包括将第三方面所述的重组工程菌置于含有氨苄抗生素的lb培养基中培养，获得种子液；将所述种子液接种于含有氨苄抗生素的lb培养基中发酵培养，在od600为0.6～1(例如0.7、0.8、0.9或1等)时加入诱导剂进行诱导培养，并离心收集菌体，用超声破碎仪破碎细胞，离心，用0.22μm的滤膜过滤上清液获得粗酶液；利用histrap纯化柱(5ml)在akta蛋白纯化仪上对粗酶液中的甲醛脱氢酶进行分离纯化，再用hitrap desalting脱盐柱(5ml)置换保藏液，获得纯化甲醛脱氢酶；利用bca蛋白定量方法测定纯化得到的甲醛脱氢酶浓度。

24、所述纯化制备方法中种子液的接种量为0.5～5％，例如0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3.0％、3.2％、3.5％、3.8％、4.0％、4.2％、4.5％、4.7％或4.9％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

25、所述纯化制备方法中诱导剂包括异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷。

26、所述纯化制备方法中诱导培养的时间为5～30h，例如6h、8h、10h、12h、14h、15h、17h、19h、20h、22h、24h、25h、27h或29h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

27、所述诱导培养温度为15～25℃，例如16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃或24℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

28、所述超声波功率为40～60％。

29、所述离心条件为8000rpm，20min，4℃。

30、本发明第四方面提供了一种以甲酸为底物合成甲醛的方法，所述方法包括利用co2活化关键甲醛脱氢酶、辅酶nadh、底物甲酸钠和缓冲液混合，进行催化反应，检测nadh消耗量和甲醛浓度。

31、所述co2活化关键甲醛脱氢酶为如本发明第一方面所述的任一种酶；所述co2活化关键甲醛脱氢酶的相关菌株为第三方面所述的相关菌株。

32、所述反应体系中辅酶nadh浓度为0.001～10.0mm，例如0.001mm、0.002mm、0.005mm、0.01mm、0.05mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.8mm或1.0mm，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，优选为0.01-1.0mm。

33、所述反应体系中底物甲酸钠浓度为0.1～1.0mm，例如0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm、1.0mm、2.0mm、3.0mm、5.0mm、7.0mm或10mm，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，优选为0.1-10.0mm。

34、所述反应体系缓冲液包括柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液或碳酸钠缓冲液中的任意一种或至少两种的组合，优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

35、所述反应体系缓冲液的ph值为4～11，例如5.5、6.0、6.2、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0或10.5，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，进一步优选为7.0。

36、所述反应体系的温度为25～55℃，例如25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

37、所述的甲醛浓度检测方法是用甲醛标准溶液配制浓度分别为0.03、0.05、0.10、0.30、0.50、1.0、3.0、5.0、10.0mm的标准溶液，利用气相色谱仪结合bid检测器制作甲醛标准曲线，并依据标准曲线确定反应液中甲醛的浓度。

38、本发明第五方面提供了一种co2为底物多酶级联合成甲醛的方法，所述方法包括(1)利用甲酸脱氢酶fdh将co2转化为甲酸；(2)利用co2活化关键甲醛脱氢酶falddh将甲酸转化为甲醛，检测nadh消耗量和甲醛浓度。

39、所述co2活化关键甲醛脱氢酶为如本发明第一方面所述的任一种酶；所述co2活化关键甲醛脱氢酶的相关菌株为第三方面所述的相关菌株。优选地，所述反应体系中辅酶nadh浓度为0.01～1.0mm；优选地，所述反应体系中底物甲酸钠浓度为0.10～10.0mm；优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

40、本发明第六方面提供了一种利用如本发明第一方面所述的甲醛脱氢酶falddh氨基酸序列、如本发明第二方面所述的甲醛脱氢酶falddh核苷酸序列、如本发明第三方面所述的基因表达载体和/或重组工程菌株在生物催化还原甲酸或co2中的应用。

41、与现有技术相比，本发明所提供的co2活化关键甲醛脱氢酶具有以下有益效果：

42、本发明所开发的新型甲醛脱氢酶均具有较高的酶活性和催化强度，可以快速合成大量的甲醛，为co2高效活化转化合成甲醛，并进一步定向转化为高值化学品的生物化学途径提供了新动力，具有潜在的应用前景。