检测RNA生物标志物的方法与流程

背景技术：

1、真核细胞的遗传物质被组织成一个由dna和蛋白质组成的复杂且动态的结构，称为染色质。染色质的主要蛋白质成分为组蛋白，其为与dna相互作用形成染色质的结构单元的碱性蛋白质，该染色质的结构单元为核小体，为核内染色体紧缩的第一级。碱性组蛋白残基与dna的酸性磷酸酯主链之间的相互作用对于确定核小体紧缩及调节复制和转录的分子复合物的可近性至关重要。此相互作用主要受核心组蛋白n-末端序列的多种翻译后修饰的影响，如甲基化、磷酸化、泛素化和乙酰化。组蛋白n-末端赖氨酸残基的去乙酰化可使胺基质子化，胺基通过带有正电荷而与dna中所含的负电荷相互作用。此类相互作用导致染色质更紧密的状态，从而导致基因表达的沉默。

2、相反地，相同残基的乙酰化会阻止离子键的形成，导致染色质较不紧密的形式，从而允许更多的dna暴露以及与活化基因转录的大分子复合物的相互作用。

3、除了这些物理化学后果外，翻译后修饰的残基也被含有“阅读器”蛋白(“reader”protein)的布罗莫结构域(bromodomain)或克罗莫结构域(chromodomain)特异性地识别，该阅读器蛋白识别甲基化或乙酰化标志物并参与被压抑或活化的染色质状态的稳定化。

4、组蛋白乙酰化程度受两类酶的活性平衡所调节：组蛋白乙酰转移酶(histoneacetyl transferase，hat)和组蛋白去乙酰酶(histone deacetylase，hdac)。此精细的平衡的改变可导致细胞内环境稳定的丧失，这在各种人的疾病中很常见，包括癌症、神经疾患、炎症和自体免疫性疾病。

5、组蛋白去乙酰酶因为其催化组蛋白n-末端赖氨酸残基的胺基的去乙酰化而被如此分类。此对于组蛋白尾部赖氨酸的酶活性进一步将它们分类为“抹除器(eraser)”，而与被称为“写入器(writer)”的hat酶相反。随后，发现这些酶有大量的底物，因为它们也对含有n-乙酰基-赖氨酸的hat酶的非组蛋白蛋白质底物发挥活性。这些底物包括转录因子、dna修复酶及许多其它核蛋白和细胞质蛋白。

6、人hdac家族由18种酶组成，分为两组：锌依赖性hdac和nad依赖性hdac，也称为sirtuin(第iii类)。锌依赖性hdac进一步分为四类：1)第i类，包括hdac1、2、3和8，主要位于细胞核中的普遍存在的同工酶；2)第iia类，包括hdac4、5、7和9，位于细胞核和细胞质中的同工酶；3)第iib类，包括hdac6和hdac10，主要位于细胞质中；和4)第iv类，仅包括hdac11。与第i类hdac不同，第iia类和某种程度上的第iib类具有组织特异性表达。

7、通过调节基因表达并作用于组蛋白和转录因子，很明显，这些酶参与了大量的细胞功能。此外，通过作用于许多蛋白质底物，这些酶参与许多其它过程，例如信号转导和细胞骨架重排。

8、在过去的20年里，已开发出数种hdac抑制剂，并有5种分子已被批准用于治疗人的癌症(伏立诺他(vorinostat)、罗米地辛(romidepsin)、贝利司他(belinostat)、帕比司他(panobinostat)和西达本胺(chidamide))。所有这些分子会抑制在正常组织中也会起作用的多种hdac亚型。因此，它们的治疗潜力受到毒性(如血小板减少症、胃肠道毒性或疲劳)的限制。

9、因此，科学界的注意力集中在针对个别hdac同种型的选择性抑制剂的合成及研究上，意图开发具有更好药理能力的分子。

10、针对特定hdac同种型(尤其是hdac6)的选择性抑制剂可以特别有用于治疗与增殖性疾患和蛋白质积累、免疫系统疾患、呼吸道疾病、神经疾病和神经退行性疾病(如中风、亨廷顿病(huntington's disease)、als和阿尔兹海默病(alzheimer's disease))相关的病症。hdac6是锌依赖性组蛋白去乙酰酶家族的成员，具有一些独特及有区别的特征，如存在具有不同催化活性且可能具有不同生物学作用的两个活性位点。hdac6底物包括α-微管蛋白、hsp90(热休克蛋白90)、皮层肌动蛋白(cortactin)、β-连环蛋白(β-catenin)。

11、hdac6对这些蛋白质乙酰化状态的调节与数个重要过程相关，如免疫反应(wang等人,nat.rev.drug disc.(2009),8(12),969-981；kalin jh等人j.med.chem.(2012),55,639-651；de zoeten ef等人mol.cell.biol.(2011),31(10),2066-2078)；微管动力学的调节，包括细胞迁移和细胞-细胞相互作用(aldana-masangkay等人,j.biomed.biotechnol.(2011),id 875824)；及错误折叠蛋白质的降解。hdac6在大多数身体组织中组成型表达，并具有普遍的细胞溶质定位，尽管它也在核区室中发挥活性。hdac6活性在病症(如癌症、神经病变、呼吸道疾病和自体免疫性病症)中发生改变(li,t.,zhang,c.,hassan,s.,liu,x.,song,f.,chen,k.,zhang,w.,和yang,j.(2018).histone deacetylase 6incancer.journal of hematology&oncology 11,111)；prior,r.,van helleputte,l.,klingl,y.e.,和van den bosch,l.(2018).hdac6 as a potential therapeutic targetfor peripheral nerve disorders.expert opinion on therapeutic targets 22,993-1007)。

12、在癌症的背景下，hdac6已被认为是肿瘤微环境功能的关键调节剂，其通过调节免疫细胞和肿瘤细胞中pd-l1的表达来控制抗肿瘤免疫反应。hdac6也参与调节癌蛋白的表达，尤其是在血液肿瘤中，如各种类型的白血病(fiskus等人,blood(2008),112(7),2896-2905；rodriguez-gonzales,blood(2008),112(11),abstract 1923)和多发性骨髓瘤(hideshima等人,proc.natl.acad.sci.usa(2005),102(24),8567-8572)。hdac6对α-微管蛋白乙酰化的调节可能与转移的发生有关，其中细胞运动发挥重要作用(sakamoto等人,j.biomed.biotechnol.(2011),875824)。

13、此外，与具有剂量限制性毒性的非选择性hdac抑制剂的临床前及临床观察形成鲜明对比的是，hdac6抑制剂没有显示出任何明显的毒性征象。而且，hdac6敲除小鼠可存活，发育正常，且没有明显的病理改变征象。这与去除其它hdac亚型表达时观察到的情况形成对比。

14、总之，hdac6的选择性抑制剂有望在耐受性非常良好的同时具有相当大的治疗潜力。

15、在wo2018/189340中，我们公开了一种特别有效的hdac6抑制剂，n-羟基-4-((5-(噻吩-2-基)-1h-四唑-1-基)甲基)苯甲酰胺，已发现其在调节抗肿瘤免疫反应中具有突出的活性。与hdac6抑制剂已知的优异耐受性一致，此分子在大鼠、小鼠和犬中具有良好的耐受性(1000mg/kg)，暗示它在人中也将具有良好的耐受性。

16、用hdac6抑制剂瑞科诺他(ricolinostat)和ka2507获得的临床数据进一步支持此假设，显示这些抑制剂在患者中具有非常良好的耐受性(amengual je等人oncologist(2021)3:184-e366；tsimberidou am等人clin cancer res(2021)27:3584-3594)。

17、虽然对药物而言是非常理想的，但没有毒性副作用对其临床开发提出了挑战。

18、传统上，肿瘤学第一期临床试验计划书(clinical protocol)会计划剂量递增直至达到最大耐受剂量。通常在此剂量水平上扩大队列，且推荐的第二期剂量源自耐受性、pk和初步疗效征象的信息。在没有任何毒性副作用的情况下，需要使用其它参数来定义剂量。

19、生物标志物对于确定生物有效剂量可以非常有帮助。

20、us2012/176076公开了一种用于在患有多发性骨髓瘤的受试者中确定组蛋白去乙酰酶6抑制剂(hdac6)的治疗功效的试剂盒，该试剂盒包含特异性地结合选自mirna(seq idn.1-23)、mrna(seq id n.24-25)和小的非编码rna(seq id n.26-27)的hdac6生物标志物rna的检测剂。编码蛋白质的mrna序列只有seq id n.24，其对应于智人缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1)亚基α(hif1a)，转录变体2mrna；和seq id n.25，其对应于智人蛋白质酪氨酸磷酸酶受体u型(protein tyrosine phosphatase receptor type u)(ptpru)，转录变体2mrna。

21、对于hdac6抑制剂，微管蛋白乙酰化水平的增加可用作读数(readout)。例如，接受一剂量的hdac6抑制剂的患者将在施用药物后的不同时间点经历抽血，并可使用蛋白质印迹分析来测定在pbmc中的乙酰微管蛋白。虽然相对简单，但此方法是定性或半定量的，并测量与抗肿瘤活性没有直接关系的药效性标志物。

22、因此，需要一种基于患者样品中可评估的生物学标志物的定量方法，该方法可用于评估hdac6抑制剂的药理活性剂量，尤其是评估化合物n-羟基-4-((5-(噻吩-2-基)-1h-四唑-1-基)甲基)苯甲酰胺的药理活性剂量。

23、定义

24、除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号及其它科学术语意图具有本公开所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语；因此，本文包括的此类定义不应被解释为表示与本领域中一般理解的定义的实质差异。

25、术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被理解为开放式术语(意指“包括，但不限于”)，且也应被视为对术语如“基本上由……组成(essentially consist of、essentiallyconsisting of)”、“由……组成(consist of、consisting of)”的支持。

26、术语“基本上由……组成(essentially consist of、essentially consistingof)”应被理解为半封闭式术语，意指包括不影响本发明的新颖特征的其它成分(因此可包括任选的赋形剂)。

27、术语“由……组成(consist of、consisting of)”应被理解为封闭式术语。

28、本文中的术语“基因表达印记”是指源自用作生物标志物的数种mrna或rna(即转录本)的组合的表达模式。

29、根据本发明，术语“rna生物标志物的表达水平”是指对特定基因(生物标志物)的rna或mrna进行测定和/或定量，如对与对照相比的rna或mrna的过度表达或表达不足进行测定和/或定量；测定样品中存在或不存在rna或mrna；测定rna的序列；测定rna的任何修饰、或测定rna的任何突变或变异。可测定rna水平是存在或不存在，高于或低于对照，或给定rna量的数值，如每微升的rna拷贝数。可通过绝对或相对定量来对rna的表达水平进行定量。绝对定量可通过包括已知浓度的一种或多种靶核酸并参考未知物与已知靶核酸的杂交强度来达成(例如，通过生成标准曲线)。或者，相对定量可通过比较两个或更多个基因之间的杂交信号或处理/未处理之间的杂交信号来达成，以对杂交强度的变化进行定量，并暗示对转录水平的变化进行定量。

30、本文中的术语“生物标志物”(生物学标志物的缩写)是指生物学指示物(例如转录本，即mrna)和/或一些生物学状态或病症的量度。

31、根据本发明，当与未接触治疗剂的情况下的生长相比，若肿瘤大小或癌症的生长速率由于接触治疗剂而受到抑制，则受癌症影响的患者对治疗剂是“有反应的”。可以多种方式测量癌症的生长。例如，肿瘤的大小或测量适合该肿瘤类型的肿瘤标志物的表达。

32、当与未接触治疗剂的情况下的生长相比，若肿瘤大小或癌症的生长速率并未由于接触治疗剂而受到抑制或抑制程度非常低，则受癌症影响的患者对治疗剂是“无反应的”。如上所述，可以多种方式测量癌症的生长，例如，肿瘤的大小或测量适合该肿瘤类型的肿瘤标志物的表达。

33、对治疗剂无反应的特征是高度可变的，不同的癌症在不同的条件下对给定的治疗剂呈现出不同水平的“无反应性”。更进一步地，无反应性的量度可使用除了肿瘤生长大小之外的额外标准评估，例如但不限于患者生活质量和转移程度。

34、根据本发明，术语“上调”、“上调的”、“过度表达”及其任何变化可互换使用，是指生物样品中生物标志物的值或水平大于通常在来自健康或正常个体的类似生物样品中所检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。该术语也可指生物样品中生物标志物的值或水平大于可在特定疾病的不同阶段检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。

35、根据本发明，术语“下调”、“下调的”、“表达不足”及其任何变化可互换使用，是指生物样品中生物标志物的值或水平小于通常在来自健康或正常个体的类似生物样品中所检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。该术语也可指生物样品中生物标志物的值或水平小于可在特定疾病的不同阶段检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。

36、此外，与表明或象征个体正常过程或者不存在疾病或其它病症的生物标志物的“正常”表达水平或值相比，过度表达或表达不足的生物标志物也可称为“差异表达”或具有“差异水平”或“差异值”。因此，生物标志物的“差异表达”也可指生物标志物从“正常”表达水平的变化。

37、根据本发明，术语hdac6抑制剂的“生物活性”是指本发明所述的任何基因的表达的调节/变化。

38、根据本发明，术语“有效剂量”是指可被认为有效治疗患者癌症的hdac6抑制剂的剂量。

技术实现思路

1、我们惊奇地发现，我们的选择性hdac6抑制剂n-羟基-4-((5-(噻吩-2-基)-1h-四唑-1-基)甲基)苯甲酰胺(也称为itf3756)可在经促炎刺激(pro-inflammatory stimuli)活化的骨髓细胞中上调和/或下调不同基因的表达，且其可对未刺激人单核细胞和经tnf-α处理人单核细胞两者的基因表达产生更广泛的影响。

2、特别是，已观察到以tnf-α刺激的人单核细胞强烈上调pd-l1基因，且pd-l1的表面表达和这些上调被itf3756抑制。

3、此外，在实验部分所报告的体外数据证实，以itf3756处理人单核细胞会上调nbeal2、fatp1/scl27a1、ltbp4、cd40、anxa6和irf6基因的表达以及下调cd84、cd276、rank/tnfrsf11a、cxcl2、cxcl3、cd163、cd204/msr1、cd206/mrc1、ada、mmp9和stab1基因的表达。

4、因此，发明人获得的结果导致鉴定出一组基因，也称为“基因表达印记”，其可被hdac6抑制剂直接调节，更具体而言可被分子itf3756调节，并可用作对此类分子的临床开发至关重要的基因表达印记。

5、此外，所述数据也已从体内获得的实验数据得到证实，其中观察到在携带ct26的动物中，mmp9基因显著下调，且irf6及cd40基因上调，这与itf3656治疗组的有反应者动物相关，证实所述基因的表达水平与hdac6的抑制剂在经治疗动物中的作用密切相关。

6、因此，本发明的一个实施方案是一种用于评估hdac6抑制剂的有效剂量和/或生物活性的方法，其包括以下步骤：

7、a)确定在生物样品中的由hdac6抑制剂调节并选自cd84、rank/tnfrsf11a、cxcl3、cxcl2、stab1、cd163、cd204/msr1、cd206/mrc1、mmp9、nbeal2、ltbp4、anxa6、fatp1/slc27a1、ada、cd276、cd40或irf6基因的至少一种rna生物标志物的表达水平；

8、b)比较所述表达水平与参考样品的表达水平。

9、根据优选的实施方案，所述方法在受癌症影响的患者的临床治疗期间评估hdac6抑制剂的有效剂量和/或生物活性。

10、在进一步优选的实施方案中，所述方法在受癌症影响的患者的临床治疗后评估hdac6抑制剂的有效剂量和/或生物活性。此可用于评估治疗后患者的病症。

11、根据进一步优选的实施方案，所述方法为体外或离体的方法。

12、优选地，所述参考样品源自未以hdac抑制剂治疗的健康受试者标本、源自未以hdac抑制剂治疗的受癌症影响的受试者或源自开始(t＝0)以hdac抑制剂治疗时的受试者。

13、根据优选的实施方案，所述hdac抑制剂选自突巴辛(tubacin)、突巴司汀(tubastatin)、聂图司他(nexturastat)、acy-1215、acy-738、acy-1083、ka2507、t518、sw100或n-羟基-4-((5-(噻吩-2-基)-1h-四唑-1-基)甲基)苯甲酰胺(itf3756)，优选地，所述hdac抑制剂为化合物n-羟基-4-((5-(噻吩-2-基)-1h-四唑-1-基)甲基)苯甲酰胺。

14、根据优选的实施方案，本发明的方法进一步包括步骤c)将受试者分类为对临床治疗有反应或无反应。

15、优选地，基于至少一种rna生物标志物的表达值是高于或是低于表达阈值，将受癌症影响的患者分类为对临床治疗有反应或无反应。

16、在一个示例性实施方案中，样品表达值大于表达阈值表明患者将对抗癌治疗有反应。在另一个示例性实施方案中，样品表达值低于表达阈值表明患者将对抗癌治疗无反应。

17、在另一个示例性实施方案中，样品表达值大于表达阈值表明患者将对抗癌治疗无反应。在另一个示例性实施方案中，样品表达值低于表达阈值表明患者将对抗癌治疗有反应。

18、例如在实施例中证实，mmp9的下调以及irf6和cd40的上调与有反应者动物相关。

19、在进一步示例性实施方案中，样品表达值低于表达阈值表明患者患有癌症类型，或处于癌症类型的发生风险中，或对hdac6抑制剂无反应。在另一个示例性实施方案中，样品表达值高于表达阈值表明患者患有癌症类型，或处于癌症类型的发生风险中，或对hdac6抑制剂有反应。在另一个示例性实施方案中，样品表达分数高于阈值分数表明患者的癌症亚型具有良好的临床预后。在另一个示例性实施方案中，样品表达分数低于阈值分数表明患者的癌症亚型具有不佳的临床预后。

20、根据进一步优选的实施方案，在本发明的方法中，生物标志物nbeal2、ltbp4、anxa6、fatp1/scl27a1、cd40或irf6的表达水平被hdac6抑制剂上调，且rna生物标志物cd84、rank/tnfrsf11a、cxcl3、cxcl2、stab1、cd163、cd204/msr1、cd206/mrc1、ada、cd276或mmp9的表达水平被hdac6抑制剂下调。

21、根据优选的实施方案，在本发明的方法中，评估至少rna生物标志物stab1、cd84、cd206/mrc1、mmp9、cd163、cd40和irf6的表达水平，优选地，评估至少rna生物标志物mmp9、cd40和irf6的表达水平。

22、根据进一步优选的实施方案，所述癌症选自肾上腺皮质癌、肛门癌、星状细胞瘤(astrocytomas)、皮肤基底细胞癌、膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、不明原发性癌、心脏肿瘤、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、眼内黑色素瘤、输卵管癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(gist)、生殖细胞肿瘤、睾丸癌、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、朗格汉斯细胞(langerhans cell)组织细胞增多症、白血病、肺癌(非小细胞、小细胞、胸膜肺母细胞瘤和气管支气管肿瘤)、黑色素瘤、梅克尔细胞(merkel cell)癌、间皮瘤、伴随nut基因改变的中线束癌(midline tract carcinoma)、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、副神经节瘤、副甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、脑下垂体瘤、原发性腹膜癌、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肉瘤、皮肤鳞状细胞癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、子宫癌、阴道癌、血管瘤、阴门癌以及威尔姆斯氏瘤(wilms tumor)。

23、优选地，所述癌症选自黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌和结直肠癌。

24、优选地，生物样品为组织样品或体液，优选地，所述组织样品为肿瘤活组织检查或血细胞；优选地，所述体液为血液、血清或血浆。

25、更优选地，所述血细胞为单核细胞或外周血单个核细胞(pbmc)。

26、根据本发明，所述单核细胞可从受癌症影响的患者分离，或通过体外板分离，其中单核细胞的细胞培养物已以hdac6抑制剂处理。

27、根据优选的实施方案，生物标志物为rna转录本。如本文所使用，“rna转录本”是指编码rna和非编码rna两者，包括信使rna(mrna)、选择性剪接mrna、核糖体rna(rrna)、转运rna(trna)、核小rna(snrna)和反义rna。测量生物样品中的mrna可用作检测生物样品中对应蛋白质和基因的水平的替代物。因此，也可通过检测适当的rna来检测本文所述的任何生物标志物或生物标志物组。

28、根据优选的实施方案，通过rna测序、定量rt-pcr(qrt-pcr)、数字pcr、affymetrix微阵列、定制微阵列或nanostring技术来检测步骤a)中生物标志物的表达水平。

29、生物标志物表达谱的方法包括但不限于定量pcr、ngs、northern印迹、southern印迹、微阵列、sage或可测量特定生物标志物的rna、mrna或蛋白质水平的其它技术。

30、可使用本领域技术人员已知的方法对给定样品的整体表达数据进行归一化，以针对不同量的起始材料、不同的提取和扩增反应效率进行校正。

31、根据优选的实施方案，本发明的方法的步骤a)由以下子步骤构成：

32、(i)分离pbmc和/或单核细胞；

33、(ii)提取rna样品；

34、(iii)对选自以下的至少一种rna生物标志物进行定量：cd84、rank/tnfrsf11a、cxcl3、cxcl2、stab1、cd163、cd204/msr1、cd40、cd206/mcr1、mmp9、nbeal2、ltbp4、anxa6、fatp1/slc27a1、ada、cd276和irf6基因；

35、(iv)通过对所定量的rna生物标志物进行生物信息学分析来评估不同地表达的生物标志物；

36、(v)将从(iv)点获得的结果与有反应者或无反应者患者相关联。

37、本发明的进一步实施方案为用于评估hdac6抑制剂的有效剂量和/或生物活性的试剂盒，其包含多孔板和用于测定各待检测rna生物标志物的表达水平的合适引物和/或探针。

38、优选地，所述rna生物标志物选自cd84、rank/tnfrsf11a、cxcl3、cxcl2、stab1、cd163、cd204/msr1、cd40、cd206/mcr1、mmp9、nbeal2、ltbp4、anxa6、fatp1/slc27a1、ada、cd276和irf6基因。

39、进一步优选的实施方案为用于评估hdca6抑制剂的有效剂量和/或生物活性的试剂盒，其包含多孔板和用于测定选自以下的至少一种rna生物标志物的表达水平的合适引物和/或探针：cd84、rank/tnfrsf11a、cxcl3、cxcl2、stab1、cd163、cd204/msr1、cd40、cd206/mcr1、mmp9、nbeal2、ltbp4、anxa6、fatp1/slc27a1、ada、cd276和irf6基因。