用于产生免疫细胞培养物的方法与流程

本公开提供了一种用于在完全封闭的系统中产生免疫细胞培养物的方法。具体地，本公开涉及一种免疫细胞培养物的上游产生和下游处理的方法。

背景技术：

1、免疫细胞疗法是一类使用基因工程化免疫细胞高效靶向和破坏癌细胞的疾病治疗。例如，过继性细胞疗法使用表达被设计成与癌症细胞上的某些蛋白质结合的嵌合抗原受体的car t细胞。car t细胞在治疗癌症中的使用显示出显著的肿瘤特异性和稳健的抗肿瘤免疫应答，从而产生完全应答。迄今为止，fda已经批准了四种自体car t细胞疗法产品：替沙仑赛(tisagenleucel)，用于急性淋巴母细胞白血病(novartis,2017)；阿基仑赛(axcabtagene cilleucel)，用于大b细胞淋巴瘤(gilead,2017)；布瑞基奥仑赛(brexucabtagene autoleucel)，在2020年用于套细胞淋巴瘤并在2021年复发性或难治性b细胞前体急性淋巴母细胞白血病(all)(gilead)；以及利基迈仑赛(lisocabtagenemaraleucel)，用于复发性或难治性大b细胞淋巴瘤(百时美施贵宝公司(bristol myerssquibb),2021)(young,c.m.,c.quinn和m.r.trusheim,耐用细胞和基因疗法潜在患者和财务影响：美国对产品批准、所治疗的患者和产品收入的预测(trusheim,durable cell andgene therapy potential patient and financial impact:us projections of productapprovals,patients treated,and product revenues),《今日药物发现(drug discovtoday)》,2021)。

2、尽管自体car t细胞疗法显示出显著的功效，但其存在一些限制。自体car t细胞疗法需要从患者中采集t细胞，然后进行遗传修饰以表达car并扩增，这可能需要至少2周。在此工艺期间，侵袭性肿瘤的进展可能是致命的，因为t细胞的扩增取决于输入的质量属性，并且无法优化患者的t细胞的质量可能导致较差的产量。肿瘤浸润性白细胞的扩增提供了一种有吸引力的策略，因为淋巴细胞针对抗多种肿瘤相关抗原致敏。然而，由于其耗尽的表型和有限的复制潜力，其体外扩增是无效的。除了上述之外，高昂的程序成本对自体细胞疗法提出了严峻挑战。

3、相比之下，同种异体细胞疗法可以作为一种“现成”产品来解决自体细胞疗法的挑战。由于hla-a、hla-b和hla-dr的匹配可能潜在地抵消移植物抗宿主病(gvhd)，因此根据所选个体生成的细胞疗法产品可能适用于更广泛的群体。因此，可以从健康个体的最佳t细胞亚群中生成细胞库，从而降低产生成本，同时提高适用性和有效性。因此，同种异体细胞疗法有可能打破自体细胞疗法的局限性。由于同种异体细胞疗法的前景，评估靶向各种肿瘤相关抗原的同种异体“现成”car t细胞的功效的临床试验正在进行中。鉴于细胞疗法的进展，特别是在同种异体方面，对t细胞产品的工业规模生产的要求是不可避免的。

4、虽然每剂量的car t细胞数量各不相同，但估计表明每年治疗血液系统恶性肿瘤需要3万亿个car t细胞，并且治疗实体瘤恶性肿瘤需要150万亿个car t细胞。为了满足所需的批量大小，扩大静态、2d、基于烧瓶的培养物将导致增加的劳动力、实验室占地面积、可变性、污染风险以及较差的工艺控制。由于搅拌罐生物反应器(str)的扩大转移动力学特性良好，因此其提供了极好的选项，从而满足了需求。此外，由于str是具有工艺控制功能的封闭的、自动化的、与gmp兼容的系统，因此在str中制备t细胞显著降低了劳动力、批次间的差异和污染风险。t细胞作为单个细胞非粘附性的、固有地在悬浮液中培养。这使得基于悬浮液的生物反应器适于其扩增，而不需要人工使其适应悬浮液培养条件并将其在聚集体中培养或附着在载体上。与其它细胞类型类似，t细胞的扩增对培养基中细胞代谢物，如氨和乳酸的累积敏感，并且因此需要补充培养基。即使使用进料分批培养物供应新鲜的营养物质并去除代谢物，但抑制剂在进料分批培养基变化之间的间隔中累积，可能抑制生长，从而通过灌注保证连续培养基变化。使t细胞适于在基于3d的悬浮培养物中扩增的属性也对自动的、连续的培养基变化提出了挑战。由于t细胞的直径在5-10mm的范围内，t细胞培养物的灌注一直是困难的，其主要负责因素是频繁的过滤器结垢和细胞逃逸。因此，迫切需要配备有能够使t细胞扩增的连续培养基灌注的扩大技术。

技术实现思路

1、在一些实施例中，一种在完全封闭的系统中产生免疫细胞培养物的方法，所述方法包括：获得免疫细胞；将所述免疫细胞引入到包括免疫细胞完全培养基的搅拌罐生物反应器中；用激活试剂激活所述免疫细胞以在所述搅拌罐生物反应器中产生经激活的免疫细胞；使所述经激活的免疫细胞在所述搅拌罐生物反应器中扩增以产生经扩增的免疫细胞培养物；通过与生物反应器连接的交替切向流过滤(atf)用所定义量的新鲜培养基更换用过的培养基；使所述经扩增的免疫细胞培养物在所述搅拌罐生物反应器中耗竭以产生经耗竭的免疫细胞培养物；在所述完全封闭的系统中采集所述经耗竭的免疫细胞培养物以产生所采集的免疫细胞培养物；以及将在所述完全封闭的系统中浓缩所述所采集的免疫细胞培养物，其中所述方法使得所述免疫细胞培养物的损失小于1％。

技术特征：

1.一种在完全封闭的系统中产生免疫细胞培养物的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫细胞完全培养基包括缓冲液、氨基酸、痕量元素、维生素、无机盐、葡萄糖和血清。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述搅拌罐生物反应器的体积容量为约1l至约2000l。

4.根据权利要求1所述的方法，其中在获得a)中的所述免疫细胞之前，将所述免疫细胞立即从外周血单核细胞(pbmc)群体中分离，或者在获得a)中的所述免疫细胞之前，将所述免疫细胞从pbmc群体中分离，储存延长的时间段，并且然后解冻。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫细胞衍生自多能干细胞群体。

6.根据权利要求6所述的方法，其中所述多能干细胞群体是诱导多能干细胞(ipsc)、胚胎干细胞(esc)或其组合的群体。

7.根据权利要求4所述的方法，其中分离所述免疫细胞包括：a)用包括抗体复合物和磁性颗粒的溶液洗涤所述pbmc以产生包括所述pbmc和所分离的t细胞的溶液；以及b)用磁体从所述溶液中分离所述所分离的t细胞。

8.根据权利要求1所述的方法，其中将0.25x 106个t细胞/ml至2x 106个t细胞/ml引入到所述生物反应器中。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法产生包括约10x 106个细胞/ml至约90x106个细胞/ml的活免疫细胞的免疫细胞培养物。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法产生包括至少约1亿个活免疫细胞的免疫细胞培养物。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述激活试剂包括可溶性抗体复合物。

12.根据权利要求1所述的方法，其中激活所述免疫细胞包括在37℃下将所述培养基与所述激活试剂搅拌约72小时的时间段。

13.根据权利要求12所述的方法，其中将所述免疫细胞培养物以0.15至0.5转/分钟(rpm)的尖端速度搅拌。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基在激活时间段期间的ph介于约ph 5.0与约ph 7.5之间。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增包括：

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述扩增进一步包括：iv)对扩增免疫细胞培养物进行采样；v)确定扩增t细胞培养物的细胞生长和扩增倍数；以及vi)基于所述细胞生长和所述扩增倍数用所定义量的新鲜培养基更换用过的培养基。

17.根据权利要求16所述的方法，其中当所述扩增免疫细胞培养物的活细胞密度大于1.5x 106个细胞/ml时，以每天一个器皿体积(vvd)的速率用所述新鲜培养基更换用过的培养基。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述耗竭包括：

19.根据权利要求18所述的方法，其中将所述珠粒以1:1的珠粒与细胞的比率添加到所述生物反应器中。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述采集包括：i)将所述免疫细胞培养物从所述搅拌罐生物反应器泵送到与所述搅拌罐生物反应器连接的无菌容器中；以及ii)将所述免疫细胞培养物从所述atf泵送到与所述atf的采集管线连接的所述无菌容器中。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述搅拌罐生物反应器与所述atf之间的连接是封闭的。

22.根据权利要求20所述的方法，其中在所述免疫细胞培养物在所述搅拌罐生物反应器中连续搅拌的同时，进行所述将所述细胞培养物从所述搅拌罐生物反应器泵送到所述无菌容器中。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述采集发生在总细胞培养约14天之后。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述浓缩包括所述所采集的细胞培养物的离心、沉降后的上清液去除、过滤、声学细胞处理或其组合。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述所采集的细胞培养物以约250g至3,000g离心约60分钟。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述所采集的细胞培养物的离心以约20毫升/分钟至约30毫升/分钟的流速产生包括期望细胞的生物质的流化床。

27.根据权利要求26所述的方法，其中将所述流化床泵送到无菌且封闭的容器中，以进行采集和/或储存。

28.根据权利要求24所述的方法，其中所述声学细胞处理包括以120瓦特和约50毫升/分钟至约80毫升/分钟的流速使所述所采集的细胞培养物循环通过声学流化床。

29.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫细胞在所述搅拌罐生物反应器中的所述激活和所述扩增使得t细胞培养物产生大于五种细胞因子，并且具有大于75％的中枢记忆t细胞、小于10％的效应记忆t细胞和大于10％的原初/干细胞记忆t细胞。

30.根据权利要求1所述的方法，其中将经浓缩的t细胞冷冻保存。

31.一种t细胞群体，所述t细胞通过根据权利要求1所述的方法产生。

32.一种基于t细胞的疗法，其包括通过根据权利要求1所述的方法产生的t细胞。

技术总结本公开提供了一种利用完全封闭的系统产生免疫细胞培养物的方法。技术研发人员：S·拉马斯瓦米,H·盖特拉受保护的技术使用者：隆萨沃克斯维尔股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18