用于生产乳样产物的方法与流程

本发明涉及生产乳腺腺体细胞的方法。本发明还涉及一种用于体外生产哺乳动物乳样产物的方法，例如，生产人乳样产物的方法，该方法包括：通过培养和分化，和/或包括乳细胞的乳腺样腺体类器官，生成衍生自哺乳动物诱导多能干细胞(hipsc)例如人诱导多能干细胞(hipsc)的此类乳细胞，以及从此类乳细胞和/或乳腺样腺体类器官中表达哺乳动物乳样产物，例如，人乳样产物。本发明还涉及由此类方法可获得的哺乳动物乳样产物，例如，人乳样产物。

背景技术：

1、哺乳动物并且尤其是人类的乳汁是具有多种组分的复杂流体，每种组分可充分地有助于婴儿和甚至母体的健康。越来越多证据表明人母乳在至少前6个月中是最合适的营养来源。人乳中许多组分在牛奶中要么完全缺乏，要么含量很低，要么不太活跃，而这些组分是生产婴儿配方食品的基础。其包括，例如，乳铁蛋白、生长因子、长链多价不饱和脂肪酸或低聚糖。虽然最近在婴儿配方食品组分方面有了重大发展，人乳组分当前一直被用作开发婴儿配方食品的黄金标准，要想实现人造母乳在当前制造工艺下是根本无法实现的。

2、目前，人乳的唯一来源是人类供体(进行母乳喂养的母亲)。用于非商业用途(人乳库(human milk biobank))和商业用途的捐赠均有报道。然而，母乳捐赠是有限的，并且受到监管和安全方面的严格管控，有时还受到来自伦理或宗教的约束。

3、在哺乳动物的尤其是人乳中发现的干细胞称为母乳干细胞(hbsc)。hbsc表现出高度适于人造并可在培养中分化为多种类型细胞的特点，更重要地是，hbsc可分化为形成人类乳腺腺体的小叶泡结构所需的三种细胞系(hassiotou f.等人，stem cells，2012)。然而，使用hbsc生产人母乳既不现实也不可持续，因为它需要人类供体。

4、目前已知一种具有干细胞功能的细胞系，这项技术被称为诱导多能干细胞(ipsc)。目前已提出一种可靠的用以由人类ipsc(hipsc)生成人乳腺样类器官的两步方案(ying qu等人，stem cell report，第8卷，第205-215页，2017年2月14日)。

5、相应地，本发明的目的在于提供生产乳腺腺体细胞的方法并且在培养的细胞中再现哺乳动物乳汁例如人乳的表达。本发明的目的还在于在培养的细胞中制备针对客户定制的哺乳动物乳样产物，例如人乳样产物，培养的细胞可适应于受体的特定需求和/或生成人乳生物活性物质，以补充基于牛奶的现有婴儿营养解决方案。

技术实现思路

1、本发明解决了上述技术问题。

2、本文提供了一种生产乳腺腺体细胞群体的方法，该方法包括：

3、i)在包含骨形态发生蛋白4(bmp4)和视黄酸(ra)的培养基中培养哺乳动物诱导多能干细胞(mipsc)以生成类胚体(eb)，以及

4、ii)使eb生长以生成乳腺细胞群体。

5、本文还提供了bmp4和ra用于在分化方案中增加哺乳动物诱导的多能干细胞(mipsc)分化为乳腺腺体祖细胞的分化效率的用途。

6、本文还提供了一种用于生产哺乳动物乳样产物的方法，该方法包括：

7、a)生成衍生自哺乳动物诱导多能干细胞(mipsc)的乳细胞乳腺样腺体类器官；

8、b)从此类来自哺乳动物诱导多能干细胞(mipsc)的所述乳细胞中分泌哺乳动物乳样产物，

9、其中步骤a)包括在包含bmp4和ra的培养基中培养mipsc。

10、本文还提供了是根据本文任何地方所述的方法可获得的人乳样产物。

11、本文还提供了用于治疗的如本文任何地方所述的人乳样产物。

12、最后，本文提供了如本文任何地方所述的人母乳样产物作为人乳替代物、任选地母乳喂养替代物的用途。

技术特征：

1.生产乳腺腺体细胞群体的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤i)包括在3d悬浮培养系统，例如3d悬浮条件中的mammocult培养基和bmp4中培养所述mipsc，任选地持续至少12天，从而引导所述ipsc分化为非神经外胚层细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤i)包括在3d悬浮培养系统，例如3d悬浮条件中的mammocult培养基和bmp4中培养所述mipsc，任选地持续不超过8天，从而引导所述ipsc分化为非神经外胚层细胞。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生长步骤ii)包括使所形成的eb在包含ra的3d包埋系统中生长至少30天，例如32天，以生成乳细胞，所述3d包埋系统例如由基质蛋白诸如基质凝胶和/或i型胶原蛋白构成的混合漂浮凝胶。

5.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述生长步骤ii)包括使所形成的eb在包含ra的3d包埋系统中生长不超过25天以生成乳细胞，所述3d包埋系统例如由基质蛋白诸如基质凝胶和/或i型胶原蛋白构成的混合漂浮凝胶。

6.根据权利要求4所述的方法，其中步骤ii)被进一步分为子步骤并且包括以下步骤：ii)和iii)：

7.根据权利要求5所述的方法，其中步骤ii)被进一步分为子步骤并且包括以下步骤：ii)和iii)：

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述乳腺腺体细胞是人乳腺腺体细胞。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在第0天和第10天之间，优选在第0天和第3天之间将bmp4添加到所述培养基中，其中第0天是所述ipsc首次添加到所述培养基中的时间点。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中将bmp4添加到所述培养基中持续3天。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在第10天和第15天之间，任选地在第6天和第11天之间将ra添加到所述培养基中，其中第0天是所述ipsc首次添加到所述培养基中的时间点。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中将ra添加到所述培养基中持续5天。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中将bmp4以5ng/ml至20ng/ml、优选5ng/ml、10ng/ml或20ng/ml的浓度添加到所述培养基中。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中将ra以1μm的浓度添加到所述培养基中。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述eb表达一种或多种乳腺腺体阳性祖细胞标记物，所述一种或多种乳腺腺体阳性祖细胞标记物任选地选自epcam、cd49f、muc1和gata3。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中与未用bmp4和ra处理的eb中所述乳腺腺体阳性祖细胞标记物的表达水平相比，所述eb具有增加的一种或多种乳腺腺体阳性祖细胞标记物的表达。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中至少10％、20％、

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述eb表达一种或多种乳特异性生物活性标记物，任选地是骨桥蛋白(opn)。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述eb具有增加的一种或多种乳特异性生物活性标记物的表达，任选地增加的骨桥蛋白(opn)的表达。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述eb具有增加的一种或多种乳特异性生物活性标记物的分泌，任选地增加的骨桥蛋白(opn)的分泌。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述乳腺腺体细胞形成乳细胞乳腺样腺体类器官。

22.bmp4和ra用于在分化方案中增加哺乳动物诱导的多能干细胞(mipsc)分化为乳腺腺体祖细胞的分化效率的用途。

23.用于生产哺乳动物乳样产物的方法，所述方法包括：

24.根据权利要求23所述的方法，其中步骤a)是在30天和45天之间的过程，任选地少于45天过程，任选地少于44天过程，任选地少于35天过程，任选地少于31天过程。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述方法用于生产人乳样产物，

26.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述方法用于生产人乳替代物产物，

27.根据权利要求25所述的方法，其中步骤a)i)定义如下：

28.根据权利要求26所述的方法，其中步骤a)i)定义如下：

29.根据权利要求25所述的方法，其中步骤a)i)定义如下：

30.根据权利要求26所述的方法，其中步骤a)i)定义如下：

31.根据权利要求23至30中任一项所述的方法，其中步骤a)包括根据权利要求1至21中任一项所述的方法。

32.根据权利要求23、24或31所述的方法，其中步骤a)在3d悬浮培养条件下进行。

33.人乳样产物，所述人乳样产物是根据权利要求23至32中任一项所述的方法可获得的。

34.根据权利要求33所述的人乳样产物，所述人乳样产物用于治疗。

35.根据权利要求33所述的人乳样产物作为人乳替代物，任选地作为母乳喂养替代物的用途。

技术总结本发明提供了一种用于生产乳腺腺体细胞的方法，以及一种生产哺乳动物乳样产物例如人乳样产物的方法，该方法包括：生成衍生自哺乳动物诱导多能干细胞(miPSC)例如人诱导多能干细胞(hiPSC)的乳细胞，以及从乳细胞中表达该哺乳动物乳样产物例如该人乳样产物。技术研发人员：M·马克斯德利马,V·巴赫曼,O·马什基安,A·比安奇,M·克劳泽受保护的技术使用者：雀巢产品有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18