引物组、检测试剂盒及其应用

本发明涉及环境污染领域，尤其涉及引物组、检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、氮(n)是组成氨基酸、蛋白质的基本组成成分，是所有生物体的基础。氮及其化合物在生产生活中应用广泛。然而，氮的过量“活化”导致固氮和脱氮之间失去平衡，活性氮转移至水体中，引发水体富营养化等诸多环境问题，并对水生环境以及人体健康构成威胁。微生物驱动的氨氧化过程对维持全球生态系统的氮平衡至关重要，在废水处理中已被广泛用于去除氮化合物。目前已鉴定出多种氨氧化路径：1)硝化(nh4+→no2-)；2)完全氨氧化(nh4+→no3-)；3)厌氧氨氧化(nh4++no2-→n2)；4)直接氨氧化(nh4+→nh2oh→n2)。其中，直接氨氧化(dirammox)由于独特的氮转化途径，只产生nh2oh这一中间体以及快速高效的脱氮行为受到广泛关注。直接氨氧化菌携带的dnf基因簇，可耐受高浓度nh4+，并可在好氧条件下将nh4+直接转化为n2，在废水的氮处理过程中展现巨大的应用潜力。然而，直接氨氧化菌在水体、土壤等环境中的分布和种群特征仍未可知，与其它微生物类群之间的相互作用仍不清晰，这限制了直接氨氧化菌的实际应用。因此，快速检测环境中直接氨氧化的存在，深入探索其分布、丰度，对于了解全新的氮循环过程、应用废水氮素处理至关重要！

2、常规的微生物检测方法包括菌株分离纯化、16s rrna测序、功能基因检测等。普适性的底物nh4+，难以检测的气体产物n2以及昂贵的实验成本，给直接氨氧化菌的分离纯化鉴定带来了挑战。16s rrna测序虽然可以明确微生物的群落结构，但目前已知的直接氨氧化菌数量有限，属于不同的属，如alcaligenes、pseudomonas等，难以评估环境中直接氨氧化菌的存在。

3、功能基因检测则可以有效地克服这些缺点。研究表明，功能基因分析利用简便快速的分子操作靶向功能基因，可以进一步确定环境中功能微生物的分布多样性、丰度等。例如，amoa是氨氧化菌的功能基因，已被用于探索水样、土样中氨氧化行为的存在，预估氨氧化菌的相对丰度。多项研究表明，dnf基因簇中的dnfrabc基因在dirammox过程中发挥不可或缺的作用，其中dnfa基因编码双功能酶(羟胺氧化酶、谷氨酰胺氧化酶)成为直接氨氧化过程的重要功能基因。通过分子探针的方法分析dnfa功能基因的存在状态，不仅可以便捷的获得功能微生物的存在状态，还可以通过qpcr技术定量分析功能微生物的丰度。因此，功能基因分析为在复杂环境中快速高效地检测直接氨氧化菌的存在和丰度提供了可能，为制定相应的环境治理策略提供了理论依据。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了引物组、检测试剂盒及其应用。本发明提供了一种直接氨氧化菌准确快速检测的方法及其应用，利用一对能够特异性扩增直接氨氧化菌中功能基因dnfa的引物235f-641r，直接以环境dna样品为模板，通过简单的分子操作精准快速地定性和定量特定环境中直接氨氧化菌的丰度。该方法需要的人力物力较少，适于大规模推广应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了引物组，其具有：

4、(1)、如seq id no:1和seq id no:2所示的核苷酸序列；或

5、(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

6、(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

7、本发明还提供了检测试剂盒，包括：上述引物组以及可接受的助剂。

8、本发明还提供了装置，包括：上述引物组和/或上述检测试剂盒以及可接受的部件。

9、本发明还提供了上述引物组、上述检测试剂盒和/或上述装置在检测直接氨氧化菌中的应用。

10、本发明还提供了上述引物组、上述检测试剂盒和/或上述装置在检测dnfa基因的丰度中的应用。

11、本发明还提供了检测直接氨氧化菌或dnfa基因的丰度的方法，取上述引物组、上述试剂盒或上述装置与待测样品混合，扩增，检测。

12、在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述扩增的条件包括：95℃预变性15分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，32个循环，72℃延伸10分钟。

13、在本发明的一些实施方案中，上述方法中，当检测dnfa基因的丰度时，所述检测还包括建议标准曲线的步骤。

14、本发明提供了引物组，其具有：

15、(1)、如seq id no:1和seq id no:2所示的核苷酸序列；或

16、(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

17、(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

18、本发明提供了一种直接氨氧化菌准确快速检测的方法及其应用，利用一对能够特异性扩增直接氨氧化菌中功能基因dnfa的引物235f-641r，直接以环境dna样品为模板，通过简单的分子操作精准快速地定性和定量特定环境中直接氨氧化菌的丰度。该方法需要的人力物力较少，适于大规模推广应用。

技术特征：

1.引物组，其特征在于，其具有：

2.检测试剂盒，其特征在于，包括：如权利要求1所述的引物组以及可接受的助剂。

3.装置，其特征在于，包括：如权利要求1所述的引物组和/或如权利要求2所述的检测试剂盒以及可接受的部件。

4.如权利要求1所述的引物组、如权利要求2所述的检测试剂盒和/或如权利要求3所述的装置在检测直接氨氧化菌中的应用。

5.如权利要求1所述的引物组、如权利要求2所述的检测试剂盒和/或如权利要求3所述的装置在检测dnfa基因的丰度中的应用。

6.检测直接氨氧化菌或dnfa基因的丰度的方法，其特征在于，取如权利要求1所述的引物组、如权利要求2所述的试剂盒或如权利要求3所述的装置与待测样品混合，扩增，检测。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增的条件包括：95℃预变性15分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，32个循环，72℃延伸10分钟。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，当检测dnfa基因的丰度时，所述检测还包括建议标准曲线的步骤。

技术总结本发明涉及环境污染领域，尤其涉及引物组、检测试剂盒及其应用。本发明提供了引物组，具有：如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或如所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或与所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。本发明提供了一种直接氨氧化菌准确快速检测的方法及其应用，利用一对能够特异性扩增直接氨氧化菌中功能基因dnfA的引物235F‑641R，直接以环境DNA样品为模板，通过简单的分子操作精准快速地定性和定量特定环境中直接氨氧化菌的丰度。该方法需要的人力物力较少，适于大规模推广应用。技术研发人员：俞汉青,吕俊露,刘东风,闵迪受保护的技术使用者：中国科学技术大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18