A组轮状病毒宏病毒组测序的靶向核酸捕获引物组、试剂盒和建库方法与流程

本发明属于微生物安全检测，尤其涉及a组轮状病毒宏病毒组测序的靶向核酸捕获引物组、试剂盒和建库方法。

背景技术：

1、腹泻是世界范围内引起5岁以下儿童死亡的重要原因，随着各地经济卫生水平不断提高，病毒感染已成为急性腹泻病的主要致病原，常见的病原体有轮状病毒(rotavirus，rv)、腺病毒(adenovirus)、诺如病毒(norovirus)、札如病毒(sapovirus)和星状病毒(astrovirus)等，其中轮状病毒是儿童水样腹泻最常见病原体。轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，无包膜病毒，双链rna(dsrna)病毒，由3层同心蛋白衣壳构成二十面体对称。rv基因组由11个编码蛋白质的dsrna片段构成，共编码12种蛋白质，分别为6个结构蛋白(vpl-vp4、vp6和vp7)和6个非结构蛋白(nspl～nsp6)。vp6具有群特异性抗原决定簇，根据vp6抗原性的不同，将轮状病毒分成10组(a-j)，其中a、b、c组可以感染人，a组轮状病毒(grouparotavirus，rva)是引起婴幼儿严重腹泻的主要病原。vp7和vp4衣壳蛋白具有抗原活性，根据其抗原性的不同，将轮状病毒进一步分为g基因型和p基因型，至今为止已发现了36个g基因型和51个p基因型。世界各地流行的g、p基因型及其组合型别在空间和时间上大多表现出复杂多变的特征，最常见的g基因型为g1-g4和g9，p基因型为p[8]和p[4]。由于a组轮状病毒的分子多样性高，很难设计出高灵敏度、高效率且对多种基因型通用的特异性引物，因此传统的叠瓦式扩增技术并不适用。

2、病毒基因组测序已成为病毒学研究的关键部分，完整的病毒基因组或长序列片段对于追踪暴发事件来源、识别新出现的变体或病毒必不可少。转座酶(transposase)已在dna建库中广泛应用。通过酶结构学研究，改造出可以特异性识别并同步打断rna/cdna双链的tn5转座酶，基于转座酶的rna建库方法具有更简单的操作步骤和更低的起始核酸投入量要求，已有研究使用该转座酶进行了新冠病毒和诺如病毒宏转录组的测序研究，但目前还尚未有基于tn5转座酶的a组轮状病毒rna建库方法的相关报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种a组轮状病毒的靶向核酸捕获引物组，具有较高的特异性和灵敏度。

2、本发明的目的还在于提供一种靶向性a组轮状病毒全基因组测序试剂盒，可用于a组轮状病毒宏病毒组测序。

3、本发明的目的还在于提供一种a组轮状病毒宏病毒组测序建库的方法，具有比传统rna-seq更好的基因组覆盖和测序深度，检测方法快速方便。

4、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

5、本发明提供了一种a组轮状病毒的靶向核酸捕获引物组，所述引物组的核苷酸序列如seq id no:1～seq id no:12所示。

6、优选的，所述引物组中seq id no:1～seq id no:12的质量配比为1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1。

7、本发明还提供了一种靶向性a组轮状病毒全基因组测序试剂盒，包含上述靶向核酸捕获引物组。

8、本发明还提供了上述靶向核酸捕获引物组或靶向性a组轮状病毒全基因组测序试剂盒在a组轮状病毒宏病毒组测序中的应用。

9、本发明还提供了一种a组轮状病毒宏病毒组测序建库的方法，包括以下步骤：

10、(1)提取待测样品的总rna；

11、(2)以总rna作为模板，同时加入oligo-t反转录引物和上述靶向核酸捕获引物组进行反转录，得到rna/cdna杂交链产物；

12、(3)使用tn5转座酶将rna/cdna杂交链产物片段化；

13、(4)选用高保真dna聚合酶将片段化的序列末端延伸，添加测序接头，pcr扩增得到测序文库；

14、(5)磁珠纯化。

15、优选的，所述步骤(2)中反转录体系为：rna模板8μl，10×rt mix 2μl、hiscriptiii enzyme mix 2μl、oligo-t反转录引物0.5μl、靶向核酸捕获引物组1.5μl和无核酸ddh2o 4μl。

16、优选的，所述步骤(3)反应体系为：rna/cdna杂交链产物20μl、tagment缓冲液10μl、tn5vr105μl。

17、优选的，反应完成后加入tstop solution终止反应。

18、优选的，所述步骤(4)反应体系为：rna/cdna杂交链片段化产物39μl、pcrmix扩增混合物50μl、n5xx 5μl、n7xx 5μl、tse 1μl。

19、本发明的有益效果：

20、本发明针对a组轮状病毒11条基因组构成，采取特异性逆转录引物分段设计的原则，设计得到适用于分子多样性高、保守区域少、病毒载量低的a组轮状病毒的靶向核酸捕获引物组，解决了a组轮状病毒基因组由于缺少poly-a尾不能被oligo-t引物特异性捕获的广谱筛查问题，并且有效规避了轮状病毒遗传信息保守性差的问题，以及由于rna的降解和高gc区域而导致的全长基因组反转录困难的问题。本发明可同时获得a组轮状病毒11条rna基因组的近乎全基因组序列片段(>95％)，从而提供高覆盖深度的全面分析。

21、本发明采用具有rna/cdna杂交链体外标记活性的tn5转座酶作为高通量测序建库步骤的核心，基于tn5转座酶具有识别rna/cdna杂交链并同步打断的功能，结合特异性靶向反转录步骤，设计得到适用于多片段化分布的a组轮状病毒特异性文库构建方案，实现对a组轮状病毒成本效益高、特异性强的靶向性全基因组测序，4h即可完成16个样本的同步建库工作，有效减少了操作步骤。本发明建立的高通量测序文库构建方法灵敏度高、特异性好、周期短，适用于开展大样本量的a组轮状病毒快速筛查及全基因组获取工作，可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有轮状病毒检测及监测需求的领域。

技术特征：

1.一种a组轮状病毒的靶向核酸捕获引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如seq id no:1～seq id no:12所示。

2.根据权利要求1所述的a组轮状病毒的靶向核酸捕获引物组，其特征在于，所述引物组中seq id no:1～seq id no:12的质量配比为1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1。

3.一种靶向性a组轮状病毒全基因组测序试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述靶向核酸捕获引物组。

4.权利要求2所述的靶向核酸捕获引物组或权利要求3所述的靶向性a组轮状病毒全基因组测序试剂盒在a组轮状病毒宏病毒组测序中的应用。

5.一种a组轮状病毒宏病毒组测序建库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中反转录体系为：rna模板8μl，10×rt mix 2μl、hiscript iii enzyme mix 2μl、oligo-t反转录引物0.5μl、靶向核酸捕获引物组1.5μl和无核酸ddh2o 4μl。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)反应体系为：rna/cdna杂交链产物20μl、tagment缓冲液10μl、tn5 vr105μl。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，反应完成后加入tstop solution终止反应。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)反应体系为：rna/cdna杂交链片段化产物39μl、pcr mix扩增混合物50μl、n5xx 5μl、n7xx 5μl、tse 1μl。

技术总结本发明提供了A组轮状病毒宏病毒组测序的靶向核酸捕获引物组、试剂盒和建库方法，属于微生物安全检测技术领域。本发明设计得到适用于分子多样性高、保守区域少、病毒载量低的A组轮状病毒的靶向核酸捕获引物组，并提供了用于A组轮状病毒宏病毒组测序的试剂盒。本发明还提供了一种A组轮状病毒宏病毒组测序建库的方法，基于Tn5转座酶具有识别RNA/cDNA杂交链并同步打断的功能，结合特异性靶向反转录步骤，设计得到适用于多片段化分布的A组轮状病毒特异性文库构建方案，有效减少了操作步骤，整体操作流程仅需4h。技术研发人员：刘丹蕾,张子龙,王祉怡,田相廷,田桢干,张子蕾,李深伟,陆晔,郑华军受保护的技术使用者：上海市生物医药技术研究院技术研发日：技术公布日：2024/6/13