一种提高番茄果实番茄红素含量的方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种提高番茄果实番茄红素含量的方法。

背景技术：

1、番茄(solanum lycopersicum)是重要的蔬菜和经济作物，在世界范围内广受欢迎。我国是鲜食番茄第一大生产国，也是加工番茄的第三大生产国，在世界番茄市场中具有举足轻重的地位。近年来，由于经济原因及品质问题，我国番茄酱的出口量大幅减少，加工番茄栽培面积也萎缩严重。

2、番茄红素(lycopene)含量是衡量番茄果实品质的重要指标，番茄的红色就是因它而来。作为一种功能性天然色素，番茄红素主要应用于食品添加剂、天然着色剂、化妆品等行业。番茄红素具有独特的理化性质和抗癌、抗氧化、增强免疫力、预防心血管疾病等多种生理功能。目前，番茄红素已经被世界粮农组织/世界卫生组织(fao/who)及联合国食品添加剂委员会(jecfa)认定为a类营养素。但动物和人体不能合成番茄红素，食物是唯一获取来源。目前市场上至少85％的番茄红素是来自番茄或番茄制品，这些制品中番茄红素的含量从4.2mg/100g到36.5mg/100g不等，番茄加工副产物中亦含有丰富的番茄红素。所以提高番茄中番茄红素的含量有着重要的意义。

3、目前，通过传统回交转育的方法将一个低番茄红素含量的自交系改良成高番茄红素含量的自交系，一般需要至少11代才能转育成功，包括1代杂交，至少5代的回交和5代的自交，按一年种植2代计算，至少需要5年半的时间才能完成。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种提高番茄果实番茄红素含量的方法，包括以下步骤：

2、(1)grna靶位点的设置：slsgr1基因将两个靶位点分别设计在第一个外显子和第二个外显子上，两个靶点序列间距为260bp；slnac1基因将两个靶位点均设计在第二个外显子上，两个靶点序列间距为83bp；

3、slsgr1基因第一个grna靶位点的序列如seq id no：1所示；

4、slsgr1基因第二个grna靶位点的序列如seq id no：2所示；

5、slnac1基因第一个grna靶位点的序列如seq id no：3所示；

6、slnac1基因第二个grna靶位点的序列如seq id no：4所示；

7、(2)grna表达载体的构建：通过酶切－连接，将grna整合到已构建好的植物表达载体pcgr1301-crispr/cas9中，得到pcgr1301-crispr/cas9-grna载体；

8、(3)将pcgr1301-crispr/cas9-grna表达载体导入农杆菌中，得到pcgr1301-crispr/cas9-grna农杆菌；选取番茄材料，用pcgr1301-crispr/cas9-grna农杆菌侵染其外植体组织；

9、(4)诱导愈伤组织，经潮霉素抗性筛选，得到t0代转基因阳性株系；

10、(5)获得的阳性t0代转基因株系，经基因靶位点pcr扩增与一代测序，筛选slsgr1或slnac1基因突变位点纯合的株系；再将t0代纯合株系进行自交，获得t1代株系；在t1代中筛选无外源基因插入的单株，即获得完全丧失slsgr1或slnac1基因功能且无外源基因插入的果实番茄红素含量提高的株系，分别标记为slsgr1或slnac1。

11、(6)将slsgr1或slnac1进行杂交获得f1代，再将f1代进行自交获得f2代，在f2代中筛选slsgr1和slnac1等位基因均纯合的株系，通过表型验证，获果实番茄红素含量进一步提高的株系，即为果实高番茄红素含量的材料。

12、进一步的，步骤(2)中所述的crispr/cas9骨架载体为pcgr1301。

13、进一步的，步骤(3)中所述的农杆菌为根瘤杆菌gv3101。

14、进一步的，步骤(5)中所述的检测靶位点突变的pcr引物为：slsgr-f、slsgr-r、slnac-f和slnac-r；其中，slsgr-f的核苷酸序列如seq id no：5所示；slsgr-r的核苷酸序列如seq id no：6所示；slnac-f的核苷酸序列如seq id no：7所示；slnac-r的核苷酸序列如seq id no：8所示。

15、进一步的，骤(3)中所述番茄材料为含slsgr1和slnac1基因的低番茄红素含量的番茄材料。

16、本发明还提供了上述方法所获得的番茄材料在番茄育种中的应用。

17、本发明具有以下有益效果：

18、本发明通过分别设计slsgr1和slnac1基因的grna靶位点，分别构建pcgr1301-crispr/cas9-grna表达载体，利用农杆菌介导法导入含有slsgr1和slnac1基因的低番茄红素含量的自交系材料中，以潮霉素抗性标记筛选获得阳性转基因植物；经基因测序和表型观察确定的纯合突变且不含外源基因插入的株系，再利用普通的杂交、自交手段，获得slsgr1和slnac1均完全丧失功能，且番茄红素含量进一步提高的株系。本发明可以显著提高番茄果实中番茄红素的含量，在番茄高品质分子育种中具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种提高番茄果实番茄红素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的crispr/cas9骨架载体为pcgr1301。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的农杆菌为根瘤杆菌gv3101。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的检测靶位点突变的pcr引物为：slsgr-f、slsgr-r、slnac-f和slnac-r；其中，slsgr-f的核苷酸序列如seq id no：5所示；slsgr-r的核苷酸序列如seq id no：6所示；slnac-f的核苷酸序列如seq id no：7所示；slnac-r的核苷酸序列如seq id no：8所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述番茄材料为含slsgr1和slnac1基因的低番茄红素含量的番茄材料。

6.一种如权利要求1-5所述任意一项方法所获得的番茄材料在番茄育种中的应用。

技术总结本发明属于基因工程领域，具体涉及一种提高番茄果实番茄红素含量的方法。本发明通过分别设计SlSGR1基因和SlNAC1基因的编辑靶位点，分别构建pCGR1301‑CRISPR/Cas9‑gRNA表达载体，利用农杆菌介导法分别转化到果实低番茄红素含量的番茄材料中，通过抗生素筛选获得阳性T0代转基因番茄植株；T0代自交获得T1代植株，从T1代中筛选不含有外源转基因成份但SlSGR1基因或SlNAC1基因发生纯合突变且果实番茄红素含量较高的植株；再将T1代Slsgr1和Slnac1进行杂交、自交，获得sgr1和nac1突变位点聚合且纯合的单株。技术研发人员：杨海涛,贾春平,王柏柯,王娟,杨涛,梁坤,余庆辉受保护的技术使用者：新疆农业科学院园艺作物研究所技术研发日：技术公布日：2024/6/13