一种螯合金属离子多肽的制备方法与流程

本发明属于多肽制备，具体地，涉及一种螯合金属离子多肽的制备方法。

背景技术：

1、罗汉果籽和银耳都具有较佳的蛋白质含量，且两者的氨基酸组成合理、种类较为齐全。此外，罗汉果籽和银耳通过水解可制备成蛋白肽，增强了溶解性，有利于提高其功能性和生物利用度，因此被广泛应用于食品和生物制药等领域。铁元素是人体必不可缺的一种微量元素，铁元素缺乏时，容易出现头晕、眼花、心跳加快、食欲下降、易疲劳等症状。人体主要从三方面进行铁的摄入，一是从食物中摄取，二是依靠铁补充剂摄取，三是红细胞破坏释放出的铁。食物中的铁含量是一定量的，且在人体内并不能完全消化吸收，因此，现在人们常常通过铁补充剂进行补铁。

2、由于铁这种微量元素金属离子可以在一定条件下与蛋白肽反应生成多肽微量元素螯合物，这类制成螯合金属离子的多肽产品由于其性质稳定、容易被人体吸收等优点成为市场研究热点，但目前市面上未见有将罗汉果籽和银耳制备成复合蛋白物再螯合亚铁离子且具有较好dpph自由基清除能力和·oh清除能力的产品。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种螯合金属离子多肽的制备方法，解决了现有技术中存在的螯合金属离子的多肽产品dpph自由基清除能力和·oh清除能力欠佳的问题。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、一种螯合金属离子多肽的制备方法，所述制备方法具体包括如下步骤：

4、s1、预处理：将罗汉果籽和银耳进行预处理，得到罗汉果籽粉和银耳粉，备用；

5、s2、提取复合蛋白物：将罗汉果籽粉、银耳粉和去离子水混合均匀，经调节ph、两次提取、离心、干燥，得到复合蛋白物；

6、s3、超声辅助二次酶解：向复合蛋白物中加入超纯水，得到复合蛋白溶液，调节复合蛋白溶液ph，控温加入复合酶，进行一次恒温超声酶解，得到混合液c，调节混合液c的ph，添加风味蛋白酶进行二次恒温超声酶解，控温灭酶，灭酶后控速离心，得到灭酶后上清液；

7、s4、吸附、过柱、超滤：调节灭酶后上清液ph，然后加入活性炭并控温水浴震荡，得到吸附后上清液，将吸附后上清液控速过树脂柱，得到过柱液，用洗脱液对过柱液进行洗脱，得到洗脱后液，将洗脱后液进行一次超滤，得到一次滤渣和一次滤液，将一次滤液进行二次超滤，得到二次滤渣和二次滤液，二次滤渣即为复合蛋白肽，备用；

8、s5、螯合：将复合蛋白肽和氯化亚铁进行螯合、醇沉、离心、洗涤、烘干，即为螯合金属离子的多肽成品。

9、作为本发明一种优选技术方案，所述步骤s1具体为：将罗汉果籽破碎、去壳、过筛，然后控温烘干至恒重，将恒重后的罗汉果籽脱脂、晾干，再过筛，得到罗汉果籽粉，备用；将银耳洗净、控温烘干、破碎、过筛，得到银耳粉，备用。

10、作为本发明一种优选技术方案，所述过筛均为过60目筛；所述控温烘干的温度均为45-50℃；所述将恒重后的罗汉果籽脱脂具体为：将恒重后的罗汉果籽和正己烷按用量比为1g:8-10ml混合均匀并在20-25℃的水浴振荡器中提取3-4h，提取完成后静置30-35min，倒出静置后自然分离的上层有机溶剂并回收利用，将下层沉淀和正己烷重复提取两次。

11、作为本发明一种优选技术方案，所述步骤s2的操作步骤具体为：将罗汉果籽粉、银耳粉和去离子水混合均匀，得到混合液a，调节混合液a的ph，控温连续搅拌，搅拌完成后控温控速冷冻离心，得到一次上清液和一次残渣，收集一次上清液并将一次残渣重复进行二次提取，得到二次上清液，将两次得到的上清液合并，得到混合液b，调节混合液b的ph，静置，控速离心，得到沉淀，洗涤沉淀，控温冷冻干燥，即为复合蛋白物。

12、作为本发明一种优选技术方案，所述罗汉果籽粉、银耳粉和去离子水的用量比为1g:1-2g:18-20ml；所述调节混合液a的ph为调节至9.0-9.5；所述控温连续搅拌的温度为30-40℃、时间为1-1.5h；所述控温控速冷冻离心的温度为4-6℃、速度为3500-4000r/min、时间为15-20min；所述调节混合液b的ph为调节至4.5-5.0；所述静置的时间为30-35min；所述控速离心的速度为3500-4000r/min、时间为15-20min；所述洗涤沉淀为用超纯水洗涤沉淀3-5次；所述控温冷冻干燥的温度为(－80)-(－75)℃、时间为1-1.5h。

13、作为本发明一种优选技术方案，步骤s3所述超纯水的加入量为将蛋白物配置成浓度为4-5％的蛋白溶液；所述调节蛋白溶液ph为调节至8-9；所述控温加入复合酶的温度为45-50℃；所述一次恒温超声酶解的温度为45-50℃、功率为100-110w、时间为90-100min；所述调节混合液c的ph为调节至7-8；所述二次恒温超声酶解的温度为45-50℃、功率为100-110w、时间为60-90min；所述控温灭酶的温度为100℃、时间为10-12min；所述控速离心的速度为4000-4200r/min、时间为10-15min。

14、作为本发明一种优选技术方案，步骤s3所述复合酶由胰蛋白酶和碱性蛋白酶组成；所述蛋白溶液、复合酶由胰蛋白酶和碱性蛋白酶的用量比为1g:8000-9000u；7000-8000u；所述混合液c和风味蛋白酶的用量比为1g:7000-8000u。

15、作为本发明一种优选技术方案，步骤s4所述调节灭酶后上清液ph为调节至4.5-5；所述上清液和活性炭的用量比为1ml:0.07-0.09g；所述控温水浴震荡的温度为40-55℃、时间为50-60min；所述控速过树脂柱的速度为1.0-1.5ml/min；所述用洗脱液对过柱液进行洗脱具体为：采用树脂2倍体积浓度75％的乙醇为洗脱液控速1.0-1.2ml/min对过柱液进行洗脱；所述将洗脱后液进行一次超滤具体为：将洗脱液采用5kda的超滤膜控压0.3-0.4mpa进行一次超滤；所述将一次滤液进行二次超滤具体为：将一次滤液采用3kda的超滤膜控压0.3-0.4mpa进行二次超滤。

16、作为本发明一种优选技术方案，步骤s4所述过树脂柱中的树脂为经95％的乙醇溶液24h浸泡、抽滤的da-201型大孔吸附树脂。

17、作为本发明一种优选技术方案，所述步骤s5的操作步骤具体为：将复合蛋白肽和氯化亚铁混合均匀，得到混合液d并调节混合液d的ph，控温震荡螯合，冷却，得到混合液e，加入乙醇溶液醇沉，控速离心，得到沉淀，洗涤，控温烘干，即为螯合金属离子的多肽成品。

18、作为本发明一种优选技术方案，所述氯化亚铁的浓度为2mmo l/l；所述复合蛋白肽和氯化亚铁的体积比为5-6:1；所述调节混合液d的ph为调节至5.0-6.0；所述控温震荡螯合的温度为30-40℃、时间为30-40min；所述冷却为冷却至室温；所述乙醇溶液的质量浓度为95％；所述混合液e和乙醇溶液的体积比为1:8-8.5；所述醇沉的时间为4-5h；所述控速离心的速度为4500-5000r/min、时间为15-20min；所述洗涤为用无水乙醇洗涤3-5次；所述控温烘干的温度为45-50℃。

19、作为本发明一种优选技术方案，步骤s1-s5所述调节ph所用的溶液均为浓度为1mol/l的氢氧化钠溶液或浓度为1mo l/l的盐酸溶液。

20、本发明的有益效果：

21、(1)本发明创新性地选用了罗汉果籽和银耳共同处理从而提取复合蛋白物，丰富了成品的营养价值。同时，对提取出的复合蛋白物采用了二次酶解、吸附、过柱、超滤的工艺进行深制，再螯合金属离子，相较于单一的罗汉果籽多肽或银耳多肽，以及相较于不经过吸附、过柱、超滤工艺方法下制得的复合蛋白肽，本发明复合蛋白肽亚铁离子螯合能力优异，制得的螯合金属离子的多肽成品dpph自由基清除能力、·oh清除能力强。

22、(2)本发明采用了复合酶+单酶的方法进行了二次酶解，同时，在酶解过程中以超声辅助酶解，促进了体系中蛋白质的扩散系数，增强了蛋白的溶出率，进而加快了蛋白质的提取效率；此外，综合考虑了蛋白转化率和酶切位点的问题，选用了以胰蛋白酶和碱性蛋白酶复配组成复合酶作为一次酶解的酶，以风味蛋白酶单酶作为二次酶解的酶，以两次酶解实现了对复合蛋白物的深度水解，同时降低了产物的苦味，满足了口感需求。

23、(3)本发明对酶解、灭酶后的上清液采用活性炭进行吸附脱色、过树脂柱进行脱盐，除去了体系中的杂质，更降低糖类含量、盐份，在此基础上以超滤膜进行超滤，得到了与亚铁离子螯合率更高的复合肽段，即本技术以吸附、过柱、超滤对酶解、灭酶后的上清液进行深制再螯合金属离子，增加了成品中亚铁离子螯合肽的富集效果。