一种合成对羟基苯乙酮的方法与流程

本发明属于化合物的合成，具体而言，涉及一种生物酶法偶联化学合成法合成对羟基苯乙酮的方法。

背景技术：

1、对羟基苯乙酮(英文名称p-hydroxyacetophenone)，又名4-羟基苯乙酮(4-hlydroxyacetophenone)，4-乙酰基苯酚(4-acetylphenol)，对乙酰基苯酚(p-acetylphenol)，4-羟苯基甲基酮(4-hydroxyphenyl methyl ketone)，俗称针枞酚(piceo1)，常温下为白色针状结品，可燃，易溶于热水，甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、苯，难溶于石油醚。天然存在于菊科植物滨蒿的茎、叶，茵陈蒿、萝藤科植物人参娃儿藤等植物的根中。

2、对羟基苯乙酮，由于其分子中含有苯环上的羟基、酮基，因此常被作为有机合成的中间体与其他化合物反应合成许多重要物质。一般用来合成医药中间体(a-溴-对羟基苯乙酮、利胆药、解热镇痛药等药物)，其它(香料，饲料等；农药、染料、液晶材料等)。

3、另外对羟基苯乙酮因其安全、无毒的特性，已被作为更加安全的原料逐渐替代传统防腐剂应用于各类中高端化妆品之中。

4、随着人们生活品质的不断提高，绿色温和的护肤品已经成为人们追求的热点。一系列化妆品安全问题引起公众的高度关注，也使得绿色化妆品原料越来越受到业界的重视。随着社会经济的发展，人们越来越追求高品质的生活，我国未来化妆品行业将呈现出功能性、安全性、绿色环保的特点，“绿色”已成为化妆品行业产品发展的总趋势。对羟基苯乙酮的制备方法主要是化学合成法，需要用到苯酚、苯甲醚等危险化学品，如果能以更加环保的生物基材料为原料，通过酶反应合成具有芳香结构的前体，所得到的对羟基苯乙酮则会更加温和、绿色、低危险。本项目的目的是开发生物基对羟基苯乙酮的合成路线，以应对化妆品原料clean beauty的要求，更加符合iso 16128定义的“天然”标准：天然成分是仅指动植物，微生物或矿物来源的化妆品原料，包括通过物理制造或发酵生成的。天然的衍生物是指按照分子量，可再生碳含量或其它相关标准衡量时,化妆品原料分子中大于50％的部分是天然成分通过一定的化学/生物加工再加以化学改性获得。天然衍生的矿物质是指天然存在于地球中的无机物质，通过化学加工而获得的化妆品原料，其化学组成与天然矿物成分相同。非天然成分是指分子中含量大于或等于50％的部分是化石燃料来源或不在本指南规定范围内的任何一种物质来源的原料。

5、目前对羟基苯乙酮的制备方法主要有以苯酚和乙酐为原料的fries重排化法、以苯甲醚和乙酰氯为原料的傅克酰基化法和以对乙基苯酚为原料的直接氧化法。

6、如专利cni119639a公开了一种以苯酚及乙酐为原料，以3-4摩尔比的三氯化铝为催化剂一步法得邻羟基苯乙酮和对羟基苯乙酮，总产率为90.2％，其中邻羟基苯乙酮的比例为80.5％，该方法主要是制备得到邻位产物，其获得的对羟基苯乙酮收率过低。

7、专利cn110845311a则公开了一种以苯甲醚为原料，在lewis酸作用下与乙酰氯发生傅克酰基化反应生成对甲氧基苯乙酮，然后在硫化物的作用下脱甲基得到产品对羟基苯乙酮。这种方法的邻对位选择性较好，反应后微量的邻羟基苯乙酮可通过重结晶去除，但由于是两步反应，在前后两步分别加入lewis酸(通常为三氯化铝)和硫化物(乙二硫醇)，由于三氯化铝对空气和水汽较为敏感，需要消耗大量的三氯化铝才能使反应完全，而乙二硫醇化合物气味大，难处理，造成大量的废水和废气的产生。

8、fatemeh rajabi等人(catalysis communications,2011,510-513)报道了以二氧化硅负载co(ⅱ)为催化剂选择氧化对乙基苯酚制备对羟基苯乙酮的方法。该方法是以对乙基苯酚为原料，乙酸为溶剂，以二氧化硅负载co(i)为催化剂，n-羟基邻苯二甲酰亚胺为自由基引发剂，通入l atm氧气，在100℃下反应12h，得到对羟基苯乙酮，其中反应物、催化剂、自由基引发剂的摩尔比为200：1：20。对羟基苯乙酮的选择性为90％，收率为78％。

9、上述现有技术中所得产品的天然来源指数为零。因此，研发一种纯天然来源的对羟基苯乙酮的制备方法是当前研究的方向，这对节能环保、降耗减排具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种生物酶法偶联化学合成法合成对羟基苯乙酮的方法，反应环境温和，过程简单可控，生产过程及原料绿色环保，具有良好的工业化应用前景。

2、本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

3、本发明的一个方面提供了一种合成对羟基苯乙酮的方法，所述方法包括以下步骤：

4、s1：在酶i的催化作用下催化l-酪氨酸脱氨生成对香豆酸；所述酶i选自酪氨酸氨解酶、苯丙氨酸氨解酶、芳香族氨基酸氨解酶中的任一种或者两种以上的混合；

5、s2：使得对香豆酸脱羧生成4-羟基苯乙烯；

6、s3：使得4-羟基苯乙烯氧化合成对羟基苯乙酮。

7、优选地，步骤s1中所述酶i的编码基因选自类球红细菌、西班牙糖丝菌、约翰逊黄杆菌、荚膜红细菌或皮肤毛孢菌。

8、优选地，步骤s1中所述酶i的氨基酸序列如ncbi数据库中accession号为yp_001045124、wp_012023194.1、aac45282、aba69898或p10248所示。

9、优选地，步骤s1中所述l-酪氨酸例如可以是l-酪氨酸纯品或l-酪氨酸粗品或l-酪氨酸发酵液，所述酪氨酸原料的质量浓度为1％～50％。

10、优选地，步骤s1中所述酶i的用量为5od/ml～40od/ml。

11、优选地，步骤s1中所述催化反应条件为：25～37℃，时间24～48h。

12、优选地，步骤s1中所述催化反应中还包含tris-hcl，所述tris-hcl浓度为10-500mm。

13、在本发明的一个方面，步骤s2中所述使得对香豆酸脱羧生成4-羟基苯乙烯具体过程为：

14、在酚酸脱羧酶的作用下催化对香豆酸脱羧生成4-羟基苯乙烯。

15、优选地，所述酚酸脱羧酶的编码基因选自植物乳杆菌、深褐芽孢杆菌、高里假丝酵母、肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

16、优选地，所述酚酸脱羧酶的氨基酸序列如ncbi数据库中accession号为qdq19184、acj26748.1、u63827、af017117或xp_001486651所示。

17、优选地，所述对香豆酸例如可以是对香豆酸纯品或香豆酸粗品或步骤s1中得到的反应液；所述对香豆酸原料的浓度为1％～50％。

18、优选地，所述酚酸脱羧酶的用量为5od/ml～40od/ml。

19、优选地，所述催化反应条件为：25～37℃，时间24～48h。

20、优选地，所述催化反应中还包含tris-hcl，所述tris-hcl浓度为10～500mm。

21、在本发明的另一个方面，步骤s2中所述使得对香豆酸脱羧生成4-羟基苯乙烯具体过程为：

22、将对香豆酸中加入溶剂i反应脱羧生成4-羟基苯乙烯。

23、优选地，所述对香豆酸例如可以是对香豆酸纯品或对香豆酸粗品或步骤s1中得到的反应液；所述对香豆酸原料的质量浓度为1％～50％。

24、优选地，所述溶剂i选自纯净水、丙酮、乙腈、thf、dmf、dmso、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇中的一种或者几种的混合。

25、优选地，溶剂i的加入量为对香豆酸体积的2～6倍。

26、优选地，所述反应温度为100～160℃，反应时间为4～12h。

27、在本发明的一个方面，步骤s3中所述使得4-羟基苯乙烯氧化合成对羟基苯乙酮具体过程为：

28、在酚酸脱羧酶和/或(s)-1-苯乙醇脱氢酶的作用下催化4-羟基苯乙烯氧化合成对羟基苯乙酮。

29、优选地，所述酚酸脱羧酶的编码基因选自植物乳杆菌、深褐芽孢杆菌、高里假丝酵母、肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

30、优选地，所述酚酸脱羧酶的氨基酸序列如ncbi数据库中accession号为qdq19184、acj26748.1、u63827、af017117或xp_001486651所示。

31、优选地，所述(s)-1-苯乙醇脱氢酶的编码基因选自固氮弧菌。

32、优选地，所述(s)-1-苯乙醇脱氢酶的氨基酸序列如ncbi数据库中accession号为bab53033所示。

33、优选地，所述4-羟基苯乙烯例如可以是4-羟基苯乙烯纯品或4-羟基苯乙烯粗品或步骤s2中得到的反应液；所述对4-羟基苯乙烯原料的质量浓度为1％～50％。

34、优选地，所述酚酸脱羧酶和/或(s)-1-苯乙醇脱氢酶的用量为5od/ml～40od/ml。

35、优选地，所述催化反应条件为：25～37℃，时间24～48h。

36、优选地，所述催化反应中还包含tris-hcl，所述tris-hcl浓度为10～500mm。

37、在本发明的另一个方面，步骤s3中所述使得4-羟基苯乙烯氧化合成对羟基苯乙酮具体过程为：

38、在催化剂的作用下催化4-羟基苯乙烯氧化合成对羟基苯乙酮。

39、优选地，所述催化剂选自四三苯基膦钯、氯化钯、醋酸钯、(1,1-双(二苯基膦)二茂铁二氯化钯、双二亚苄基丙酮钯、钯碳、氢氧化钯碳、雷尼镍中的一种或几种的混合。

40、优选地，所述催化剂用量为4-羟基苯乙烯质量的0.3％～1％。

41、优选地，所述4-羟基苯乙烯例如可以是4-羟基苯乙烯纯品或4-羟基苯乙烯粗品或步骤s2中的反应液。

42、优选地，所述催化反应中还包含溶剂ii。

43、优选地，所述溶剂ii包括纯净水、丙酮、乙腈、thf、dmf、dmso、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇中的一种或者几种的混合。

44、优选地，所述溶剂的加入量为4-羟基苯乙烯体积的8～12倍。

45、优选地，所述催化反应中还包含加入质量分数为30％的过氧化氢水溶液的过程，所述过氧化氢的摩尔用量为4-羟基苯乙烯的4～6个当量。

46、优选地，所述催化条件为：温度70～80℃，时间18～24h。

47、优选地，在反应结束后还包括对产品纯化的步骤，具体过程为：

48、待反应结束后趁热过滤，滤去不溶物，滤液加入活性炭于100℃下搅拌脱色1～5h后趁热抽滤，将滤液倒入反应瓶中，程序降温至5～15℃，搅拌析晶8～16h后抽滤，滤饼用纯净水洗涤一次，烘干，即得到类白色粉末状固体产物对羟基苯乙酮。

49、优选地，所述干燥方式为鼓风干燥，温度为50～60℃。

50、本发明的另一个方面还提供了一种产前述的酶的基因工程菌株的构建方法，所述基因工程菌可以表达外源酪氨酸氨解酶和/或苯丙氨酸氨解酶和/或芳香族氨基酸氨解酶、酚酸脱羧酶和/或(s)-1-苯乙醇脱氢酶，所述构建方法包括以下步骤：

51、将编码酪氨酸氨解酶和/或苯丙氨酸氨解酶和/或芳香族氨基酸氨解酶、酚酸脱羧酶和/或(s)-1-苯乙醇脱氢酶的基因、一个或多个基因连接到表达质粒pbad-hisb上，构建得到重组质粒；

52、将所得表达质粒转化到大肠杆菌escherichia coli bw25113，利用氨苄青霉素平板筛选得到阳性克隆，即为重组大肠杆菌。

53、优选地，所述酪氨酸氨解酶和/或苯丙氨酸氨解酶和/或芳香族氨基酸氨解酶来自于类球红细菌、西班牙糖丝菌、约翰逊黄杆菌、荚膜红细菌或皮肤毛孢菌，由ncbi数据库中accession号为yp_001045124、wp_012023194.1、aac45282、aba69898或p10248所示的氨基酸序列组成。

54、优选地，所述酚酸脱羧酶来自于植物乳杆菌、深褐芽孢杆菌、高里假丝酵母、肠杆菌或枯草芽孢杆菌，由ncbi数据库中accession号为qdq19184、acj26748.1、u63827、af017117或xp_001486651所示的氨基酸序列组成。

55、优选地，所述(s)-1-苯乙醇脱氢酶来自于固氮弧菌，由ncbi数据库中accession号为bab53033所示的氨基酸序列组成。

56、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：本发明提供了一种生物法或生物法偶联化学合成法合成对羟基苯乙酮的方法，以l-酪氨酸为起始物料，通过三步酶催化作用，或两步酶催化作用+一步化学催化作用，或一步酶催化作用+两步化学催化作用合成对羟基苯乙酮。本发明提供的合成对羟基苯乙酮的方法，反应条件温和，过程简单可控，生产过程绿色环保，产物绿色指数高，减少了现有化学合成过程中有毒有害试剂的使用及高温高压条件，具有良好的工业化应用前景。

57、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。