一种N-脱乙酰基酶及其制备方法和用途与流程

本发明涉及酶工程和蛋白化学的，具体涉及一种n-脱乙酰基酶、其制备方法和用途。

背景技术：

1、肝素是糖胺聚糖家族中的一种线形多分散的硫酸化多糖，是由糖醛酸(l-艾杜糖醛酸，idoa和d-葡糖醛酸，glca)和氨基己糖(α-d-氨基葡糖，glcn)及其衍生物(乙酰化、硫酸化)组成的具有不同链长的多糖混合物。肝素的糖链由交替的糖醛酸和d-葡糖胺组成，主要的重复单元是2-o-硫酸化l-艾杜糖醛酸(idoa2s)α(1→4)和n-,6-o-二硫酸化d-葡糖胺(glcn6s)；较少组分是非硫酸化l-艾杜糖醛酸和d-葡萄糖醛酸，以及n-乙酰基d-葡糖胺和n-,3-o-,6-o-三硫酸化d-葡糖胺(casub.,2005.“structureandactivedomainsofheparin.”in:chemistryandbiologyofheparinandheparansulfate.amsterdam:elsevier.1-28；casub.和lindahlu.,2001,“structureandbiologicalinteractionsofheparinandheparansulfate.”adv carbohydrchembiochem,57:159-206)。通过化学方法或酶法部分降解普通肝素(又称未分级肝素)可以得到低分子肝素，其分子量小于8000。肝素及肝素衍生物是糖胺聚糖家族中结构最为复杂的成员之一，在二糖水平上，存在多种结构变异，导致肝素及其衍生物的序列具有微观不均一性。

2、肝素是广泛存在于动物器官和组织中的一种糖胺聚糖，肝素及肝素类衍生物肝素可有效地抑制乙酰肝素酶、可与抗凝血酶结合，具有抗凝、抗炎、抗癌等多种生物学功能，但长期使用会有许多负面影响，如出血和诱导血小板减少等。肝素及肝素类衍生物的生物学作用机制及构效关系十分复杂，与其精细结构(如寡糖链的长度、末端结构、硫酸基团及乙酰基团的数目和位置等)非常密切的关系，结构表征是功能研究的基础。

3、目前，现有技术已经公开了部分对肝素及其衍生物的构效关系及其结构修饰研究，但使用酶法脱除肝素及其衍生物中的乙酰基的方法报道较少。因此，急需一种单一功能地、能脱出肝素及其衍生物中乙酰基且不影响肝素结构中其他基团的工具酶，以期更好的进行肝素及其衍生物的构效关系及其结构修饰研究。

技术实现思路

1、本发明第一方面提供：

2、密码子优化的n-脱乙酰基酶的编码基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明第二方面提供：

4、n-脱乙酰基酶制备方法，包括如下步骤：

5、(1)基因合成及克隆：构建包含seq id no:1所示核苷酸序列的重组杆状病毒转移载体，合成包含seq id no.1所示核苷酸序列的基因片段，连接至载体pfastbac1-mellitin质粒构建重组杆状病毒转移载体；

6、(2)杆状病毒质粒bacmid的构建：将构建好的pfastbac1-mellitin质粒转化进dh10bac菌株感受态，利用蓝白斑筛选挑选出阳性克隆，进行pcr鉴定，凝胶电泳检测目的条带是否符合预期，条带正确的克隆即包含构建成功的bacmid杆粒，提取质粒；

7、(3)杆状病毒质粒bacmid转染并获得病毒：将提取的重组杆粒bacmid与脂质体复合后转染到sf9细胞，培养4～6天后，观察转染后细胞出现感染病毒迹象即可收取培养基，离心后上清即为p1代病毒，培养sf9细胞，贴壁后加入收获的p1代病毒储存液，27℃培养2～4天，收集瓶内上层培养基，离心除去细胞及其碎片等，收集上清即为扩增后的p2代重组病毒；取生长至对数期的sf9细胞，加入上一步收获的p2代病毒，27℃摇床培养；每天观察细胞染毒现象，至一半以上细胞明显感染后(5～6天)，细胞4℃离心，上清即为第三代病毒p3；

8、(4)蛋白表达：取生长至对数期(细胞浓度约2.0×106个/ml)的sf9细胞300～500ml，按照1:20～1:40的比例加入p3代病毒，并在3～5天后收集上清中表达的蛋白；上清分两次离心，第一步低转速初离心，5000rpm离心30分钟，第二步高转速离心上清转移到新的离心瓶在10000rpm转速下再离心30分钟；

9、(5)蛋白纯化：将过滤好的上清流过hep柱，之后用tbsbuffer200ml左右冲洗杂蛋白；用含1.5m的nacl的tbs(ph7.4)buffer约50ml洗下目的蛋白，将上步洗下的含目的蛋白组分的溶液上样平衡好的ni柱，用50ml含20mm咪唑的tbs(ph7.4)冲洗杂蛋白，再用20ml含50mm咪唑的tbs(ph7.4)含有冲洗杂蛋白，用含300mm咪唑的tbs将目的蛋白从柱上洗脱下来，收集组分待检。

10、优选的，为了提高蛋白的表达量，步骤(3)进一步扩增p4代病毒，方法与上述p3代病毒的制备方法相同，即将p3代病毒继续按1％-2％的接病毒比例再感染sf9细胞，5至6天后收p4代病毒。

11、优选的，步骤(4)中上述两次离心后的上清，还需经过一次0.45μm的聚醚砜材质(pes)的滤膜过滤。

12、优选的，步骤(5)进一步进行分子筛或者离子柱纯化。

13、本发明第三方面提供：

14、一种n-去乙酰化酶活性检测的方法，包括利用硫酸乙酰肝素hs或其它带n-乙酰基的肝素类似物进行降解检测，采用nmr法或色谱法比较降解前后样品在n-乙酰基结构上的变化来判断酶活性。

15、本发明第四方面提供：

16、一种n-去乙酰化酶，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

17、有益效果

18、肝素是一种具有抗凝血功能的糖胺聚糖类天然药物，其化学本质是长短不一的酸性粘多糖长链的混合物，由硫酸化或乙酰化不同的己糖醛酸(ua)和葡萄糖胺(glcn)双糖单位交替连接构成，形成分子量4～40kda的糖链混合物。由于动物组织提取肝素存在污染的潜在风险及依赖于原材料的供应，酶法合成肝素成为现在的研究热点也是亟待实现突破的生物方法。

19、n-去乙酰化酶/n-磺基转移酶(n-deacetylase/n-sulfotransferase，简称ndst)，是广泛存在于高等哺乳动物体内的一类双功能酶，同时具有n-去乙酰化和n-磺基化的功能，在动物体内的肝素/硫酸乙酰肝素合成过程中起着关键作用：用磺基取代肝素前体上的乙酰基团，从而赋予肝素/硫酸乙酰肝素特殊且关键的生物学活性。迄今为止，在人体内发现了4个不同的ndst蛋白ndst1～4，具有不同的n-脱乙酰/n-硫酸转移酶活性，其中ndst1和ndst2分布最广，并被应用到肝素和硫酸化乙酰肝素的生物合成中。

20、ndst是启动硫酸乙酰肝素多糖链硫酸化修饰的关键酶，在目前的酶法合成肝素的报道中，肝素前体多糖在ndst的作用下催化生成n-硫代葡萄糖胺(glcns)，n-硫酸基被引入到糖胺聚糖链上。现ndst多利用哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞cho表达系统进行重组表达纯化，但成本较高，制备周期较长，生长条件复杂操作繁琐。

21、本专利选取易于操作、容易放大培养、可以高效表达外源基因且能实现蛋白翻译后修饰的昆虫表达体系进行表达和纯化，并且截取了n-去乙酰化酶/n-磺基转移酶ndst1的n-去乙酰化酶结构域，简化基因，成功纯化具有单一n-去乙酰化活性的n-脱乙酰基酶(简称ndase)，并实现了硫酸乙酰肝素上n-乙酰基的降解，能够用于肝素的酶法合成及结构修饰。

22、因此，本项目纯化的n-脱乙酰基酶具有重要意义：

23、(1)ndst是肝素酶法合成中最重要的工具酶，生物合成肝素依赖于酶的生产。

24、(2)本发明的ndase是通过取ndst1的n-去乙酰化酶结构域，进行重组表达，得到单一功能的ndase。该ndase能够实现酶功能的单一化，并且由于蛋白质链一定程度的缩短，合成难度也得到一定的降低。

25、(3)肝素及肝素类糖胺聚糖具有不同的硫酸化程度，也给这种多糖带来了不同的生物活性。在不需要加入硫酸基供体进行磺基转移的情况下，本发明提供的利用单纯的ndase仅会催化并实现葡萄糖胺的n-去乙酰化，不会进行磺酸基的转移，更有利于对肝素、低分子肝素及肝素类似物的结构进行研究，最大化实现酶的价值。

26、(4)本发明建立的昆虫表达系统表达纯化n-脱乙酰基酶的稳定工艺方法，不限于改造后的ndase，任何人源乃至哺乳细胞来源的酶理论上都可以用此方法通过杆粒构建、病毒转染、昆虫细胞表达进行重组表达纯化。