一种提高缬氨酸产量的方法及应用与流程

本发明涉及生物工程，尤其涉及一种提高缬氨酸产量的方法及应用。

背景技术：

1、支链氨基酸(branch chain amino acid，bcaa)包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。其中，l-缬氨酸(l-valine)，化学名称为l-α-氨基异戊酸，分子式为c h11no2，相对分子质量为117.15。l-缬氨酸呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中25℃的溶解度为88.5g/l，50℃的溶解度为96.2g/l，不溶于冷乙醇、乙醚、丙酮，等电点为5.96，熔点为315℃。

2、l-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。l-缬氨酸可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。其中，在医药工业中，l-缬氨酸可作为氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱。在食品工业中，l-缬氨酸可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。l-缬氨酸也可用作氨基酸功能饮料与运动员饮料，具有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。在饲料工业中，l-缬氨酸对动物的乳腺组织分泌乳汁具有重要的促进作用。

3、目前，l-缬氨酸的生产方法主要包括三种：提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受到限制、生产成本高、污染环境等问题，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产l-缬氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产l-缬氨酸最主要的方法。但目前l-缬氨酸菌种的发酵性能仍较差，且副产物亮氨酸的含量较高，导致转化率仍较低，较难满足大规模工业化生产的需求。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种提高缬氨酸产量的方法及应用。通过微压条件结合厌氧发酵，显著提高微生物生产缬氨酸的产量和转化率。

2、第一方面，本发明提供一种提高微生物的缬氨酸产量的方法，包括：

3、一级种子培养、二级种子培养和发酵培养；

4、所述一级种子培养、二级种子培养和发酵培养过程中保持无氧状态；

5、所述二级种子培养和发酵培养过程中的压力维持在0.01～0.03mpa。

6、进一步地，所述二级种子培养和发酵培养过程中的压力维持在0.018～0.022mpa。

7、进一步地，所述保持无氧状态包括：

8、在所述一级种子培养中，保持不通气无氧状态；

9、在所述二级种子培养和发酵培养中，通入无氧气体；所述无氧气体包括如下中的一种或多种：

10、氮气、二氧化碳、氢气、一氧化碳、一氧化氮、甲烷、氦气或氩气。

11、进一步地，所述无氧气体为二氧化碳；所述二氧化碳的通入方法包括：

12、每1.5～2.5小时通入一次二氧化碳，每次通入的量为培养空间体积的10～20％。

13、进一步地，所述二氧化碳的通入方法包括：

14、每2～2.2小时通入一次二氧化碳，每次通入的量为培养空间体积的15～25％，优选为20～25％。

15、进一步地，所述发酵培养过程的温度为36～38℃；优选为37～38℃。

16、进一步地，所述发酵培养的过程使用的发酵培养基包括：

17、葡萄糖20-50g/l、mgso4·7h2o 0.5-2.5g/l、酵母粉0.5-2.0g/l、(nh4)2so4 2.0-5.0g/l、kh2po4 1.0-3.5g/l、甜菜碱盐酸盐0.5-2g/l、氨基酸粉(硫酸型)0.1-0.5g/l、feso4·7h2o 1.0-2.5mg/l、cocl2·6h2o0.1-0.5mg/l、cuso4 0.1-0.5mg/l、znso4·7h2o0.1-1.0mg/l、na2moo4·2h2o 0.1-0.5mg/l、h3bo3 0.01-0.1mg/l和mnso4·h2o0.1-1.0mg/l。

18、进一步地，所述发酵过程中，转速为200～500rpm，ph为6.8～7.0，葡萄糖浓度为0.1～20g/l。

19、进一步地，所述微生物为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌中的一种或多种；

20、优选为大肠杆菌atcc8739或其衍生菌株、大肠杆菌atcc25922或其衍生菌株或大肠杆菌atcc35150或其衍生菌株中的一种或多种。

21、进一步地，所述微生物为大肠杆菌tys8789，该菌株已经公开于中国专利cn202210248471.9。

22、进一步地，在所述发酵过程之前，一级种子培养使用的培养基包括：

23、a组分：葡萄糖20-80g/l、mgso4·7h2o 0.5-2.5g/l。

24、b组分：酵母粉(安琪)5-10g/l、蛋白胨(oxoid)5-10g/l、(nh4)2so42.0-13.2g/l、kh2po4 1.0-3.5g/l、k2hpo4·3h2o 1.0-5.0g/l，灭菌前用5mol/l koh调ph7.2-7.4。

25、将a组分与b组分在无菌条件下混合，即为一级种子培养基。

26、进一步地，在所述发酵过程之前，二级种子培养使用的培养基包括：

27、c组分：葡萄糖20-30g/l、mgso4·7h2o 0.5-2.5g/l。

28、d组分：酵母粉(安琪)0.5-2.0g/l、(nh4)2so4 2.0-5.0g/l、kh2po41.0-3.5g/l、甜菜碱盐酸盐0.5-2g/l、l-丙氨酸0.1-0.5g/l、vb10.1-1.0mg/l、feso4·7h2o 1.0-2.5mg/l、cocl2·6h2o 0.1-0.5mg/l、cuso4 0.1-0.5mg/l、znso4·7h2o 0.1-0.5mg/l、na2moo4·2h2o0.1-0.5mg/l、h3bo3 0.01-0.1mg/l。

29、将c组分与d组分在无菌条件下混合，即为二级种子培养基。

30、本发明具备如下有益效果：

31、本发明通过大量试验探索发现，无氧和微压条件对产缬氨酸有促进效果，进而采用厌氧结合微压控制的方法提高微生物生产缬氨酸的能力，发现在一定微压条件下可以大幅度提高微生物生产缬氨酸的产量和转化率。本发明提供的方法为发酵法生产其他氨基酸产品、核苷类产品提供借鉴，且适合工业化生产。

技术特征：

1.一种提高微生物的缬氨酸产量的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二级种子培养和发酵培养过程中的压力维持在0.018～0.022mpa。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述保持无氧状态包括：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述无氧气体为二氧化碳；所述二氧化碳的通入方法包括：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述二氧化碳的通入方法包括：

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养过程的温度为36～38℃；优选为37～38℃。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的过程使用的发酵培养基包括：

8.根据权利要求1或6或7所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中，转速为200～500rpm，ph为6.8～7.0，葡萄糖浓度为0.1～20g/l。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌中的一种或多种；

10.权利要求1-9任一项所述方法在提高大肠杆菌生产缬氨酸的产量和转化率中的应用。

技术总结本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种提高缬氨酸产量的方法及应用。所述方法包括：一级种子培养、二级种子培养和发酵培养；所述一级种子培养、二级种子培养和发酵培养过程中保持无氧状态；所述二级种子培养和发酵培养过程中的压力维持在0.01～0.03MPa。本发明发现在全程无氧和微压条件下，微生物生产缬氨酸的能力会显著提高，缬氨酸糖酸转化率也显著提高。本发明提供的方法可以显著提高微生物生产缬氨酸的产量和转化率，在缬氨酸生产领域具有重要意义。技术研发人员：吴涛,陈钊,褚凡,高鹏,李岩,赵津津受保护的技术使用者：廊坊梅花生物技术开发有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18