提升梭菌气体发酵性能的方法

本发明属于代谢工程领域，涉及一种提升梭菌气体发酵性能的方法，具体涉及一种提升永达尔梭菌(clostridium ljungdahlii)利用一碳气体(co2、co)能力的方法。

背景技术：

1、一碳气体(或称c1气体，一般指co2、co)的生物转化利用不仅可以有效降低生物制造产业的原料成本，增强市场竞争力，而且有助于缓解一碳废气排放所引发的环境问题，对社会可持续发展具有重要意义。化能固碳微生物可利用含能物质氧化反应释放的能量来转化和固定一碳气体，其过程不受光照条件的限制，适用于工业规模的高密度发酵工艺，具有良好的应用前景。

2、食气梭菌是一类重要的化能固碳微生物，能够以h2或co作为能量，其通过wood-ljungdahl途径固定co2和co。与其它化能固碳微生物如硝化细菌、铁硫细菌相比，食气梭菌对一碳气体的转化效率较高，且菌株的实验室分离、纯化和培养技术更加成熟。因此，以食气梭菌作为底盘细胞，通过发酵工艺优化和代谢工程改造等策略实现c1气体的高效转化和利用成为研究的热点。然而，食气梭菌作为底盘细胞在c1气体原料的吸收利用、产物合成种类和效率方面仍存在明显不足，亟待改造和提升。

技术实现思路

1、为解析食气梭菌的c1气体转化和利用的瓶颈，提升食气梭菌的c1气体固定能力，发明人提出以下设想：通过对食气梭菌气体发酵中间产物的测定，找到气体代谢途径--wood-ljungdahl途径的限速步骤，并采用代谢工程改造的策略疏通途径限速步骤，进而提升菌株一碳气体固定和溶剂合成能力。选择食气梭菌代表性菌株--永达尔梭菌(clostridium ljungdahlii)为研究对象，以模拟钢厂尾气为碳源(co-co2-h2-n2，各组分体积比例为56％/20％/9％/15％)的合成气进行c1气体发酵。通过对发酵产物的分析和测定，发现c1气体代谢途径--wood-ljungdahl途径的中间代谢物甲酸在胞内有累积，暗示该气体代谢途径中的中间体--甲酸的转化是一个限速步骤。据此推测，如果能够疏通甲酸代谢通路，那么也有可能同时提高永达尔梭菌对co2/co的利用能力。于是对目前已知的甲酸代谢途径的基因进行过量表达，实验发现过量表达永达尔梭菌自身的丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因pflab可以提升其发酵气体的能力，这是从未报道的一个新发现。进一步地，发明人在上述过表达酮酸甲酸裂解酶的菌株中还过量表达了乳酸脱氢酶基因ldh(clju_c00970、clju_c21570)，目的是促进丙酮酸转化为乳酸，从而进一步拉动上游甲酸和乙酰辅酶a至丙酮酸的转化。通过对工程菌株的气体发酵和表型分析，发现过量表达基因ldh进一步提高了菌株的气体发酵生物量和乙酸、乙醇合成能力。基于上述研究成果，本发明包括如下技术方案：

2、一种提升梭菌气体发酵性能的方法，包括下述步骤：使食气梭菌过表达丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate formate lyase，pfl)，得到菌株a。

3、所述丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)可以是内源性的，也可以是外源性的，可以来源于食气梭菌，也可以来源于其他微生物种类。

4、在一种实施方式中，所述丙酮酸甲酸裂解酶包括ncbi登录号clju_c25980(seqidno:1)的pflb和ncbi登录号clju_c39820(seq id no:3)的pfla，相应地，这两种丙酮酸甲酸裂解酶基因分别为pflb(seq id no:2)和pfla(seq id no:4)，编码它们的基因(簇)称为pflab。

5、进一步地，上述方法可以还包括下述步骤：使菌株a过表达乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，ldh)。

6、所述乳酸脱氢酶(ldh)可以是内源性的，也可以是外源性的，可以来源于食气梭菌，也可以来源于其他微生物种类。

7、例如，上述乳酸脱氢酶可以是ncbi登录号clju_c00970(seq id no:5)和/或ncbi登录号clju_c21570(seq id no:7)，相应地，两种乳酸脱氢酶基因皆称为ldh(seq idno:6、seq id no:8)。

8、可以通过下述方法构建过表达基因pflab和/或ldh的工程菌：将基因pflab和/或ldh亚克隆于质粒载体上，然后通过热激法、化学转化法或者电转化方法将质粒转入宿主细胞中；或者

9、通过基因编辑技术将基因pflab和/或ldh整合于宿主细胞的基因组上，所述基因编辑技术例如选自下组：同源双交换，talen系统，crispr-cas9系统，crispr-cpf1系统，crispr-cas12系统，crispr-best系统，mugent(multiplex genome editing by naturaltransformation，通过自然转化进行多重基因组编辑)等。

10、上述质粒可以是任何适合于在食气梭菌表达的载体，例如选自下组：mtl 82151、pmtl 83151、pmtl 84151、pmtl 85151、pmtl 82251、pmtl 82254、pmtl 83251、pmtl83254、pmtl 84251、pmtl 84254、pmtl 85251、pmtl 85254、pimp1。

11、优选地，上述食气梭菌是永达尔梭菌(clostridium ljungdahlii)，例如c.ljungdahlii dsm13528。

12、本发明的第二个方面提供了一种能利用一碳气体的食气梭菌工程菌，其按照上述的方法构建得到。

13、优选地，上述食气梭菌工程菌可以通过发酵将一碳气体转化为乙醇和/或乙酸。

14、本发明的第三个方面提供了上述食气梭菌工程菌在一碳气体生物利用中的用途。

15、本发明首次发现食气梭菌过表达丙酮酸甲酸裂解酶基因pflab可以提升固定利用一碳气体发酵的能力，而且进一步过表达乳酸脱氢酶基因ldh可以有效地将一碳气体转化为乙醇和/或乙酸。本发明的上述代谢工程策略可用于有效地提升食气梭菌的一碳气体生物利用效率。

技术特征：

1.一种提升梭菌气体发酵性能的方法，包括下述步骤：使食气梭菌过表达丙酮酸甲酸裂解酶，得到菌株a。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述丙酮酸甲酸裂解酶包括ncbi登录号clju_c25980(seq id no:1)的pflb和ncbi登录号clju_c39820(seq id no:3)的pfla，相应地，这两种丙酮酸甲酸裂解酶基因分别为pflb(seq id no:2)和pfla(seq id no:4)，合称pflab。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，还包括下述步骤：使菌株a过表达乳酸脱氢酶。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，乳酸脱氢酶是ncbi登录号clju_c00970(seqid no:5)和/或ncbi登录号clju_c21570(seq id no:7)，相应地，两种乳酸脱氢酶基因皆称为ldh(seq id no:6、seq id no:8)。

5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，通过下述方法构建过表达基因pflab和/或ldh的工程菌：

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述质粒是适合于在食气梭菌表达的载体，选自下组：pmtl 82151、pmtl 83151、pmtl 84151、pmtl 85151、pmtl 82251、pmtl 82254、pmtl 83251、pmtl 83254、pmtl 84251、pmtl 84254、pmtl 85251、pmtl85254、pimp1。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述食气梭菌是永达尔梭菌。

8.一种能利用一碳气体的食气梭菌工程菌，其特征在于，按照如权利要求1-7中任一项所述的方法构建得到。

9.如权利要求8所述的食气梭菌工程菌，其特征在于，通过发酵将一碳气体转化为乙醇和/或乙酸。

10.如权利要求8所述的食气梭菌工程菌在一碳气体生物利用中的用途。

技术总结本发明公开了一种提升梭菌气体发酵性能的方法，包括下述步骤：使食气梭菌过表达丙酮酸甲酸裂解酶基因pflAB，得到菌株A；还可进一步使菌株A过表达乳酸脱氢酶基因ldh。本发明的代谢工程策略可用于有效地提升食气梭菌的一碳气体生物利用效率，应用潜力巨大。技术研发人员：顾阳,贾德臣,李德茂,姜卫红受保护的技术使用者：中国科学院分子植物科学卓越创新中心技术研发日：技术公布日：2024/6/18