一种提升番茄再生芽率的复合基因、植物过表达载体、转基因工程菌和转化方法

本发明属于基因工程，具体涉及一种提升番茄再生芽率的复合基因、植物过表达载体、转基因工程菌和转化方法。

背景技术：

1、植物体细胞在特定诱导条件下完成脱分化并形成愈伤组织（或体细胞胚），进而发育成为独立个体的过程被称为植物组织培养，它是现今获得转基因作物的主要方式。在组织培养过程中，再生效率的高低直接影响目的基因转化的成功率。因此，提高再生效率并提高转化效率对于基因功能的研究至关重要。

2、近年来，利用植物生长调节基因提升遗传转化效率已在小麦、水稻、玉米、油菜、柑橘、向日葵等作物中得到应用，如植物器官和胚胎发生过程中起重要作用的baby boom（bbm）和wuschel2（wus2）基因，过表达可显著提高玉米的转化效率；wind1基因的异位表达可以使拟南芥、油菜和欧芹在无损伤或生长素预处理的情况下，促进外植体再生芽生长。

3、番茄（solanum lycopersicum）又称西红柿，属于茄科（solanaceae）番茄属植物，番茄果实不仅营养丰富、色彩多样、酸甜可口，而且产量高、适应性强，在世界范围内被广泛种植。番茄既可以作为蔬菜食用又可以作为水果鲜食的属性深受世界人民的青睐，在全球经济发展和食物供给中占有重要地位。番茄作为植物转基因研究的主要模式植物之一，其遗传转化体系已经报道了很多，但目前缺少提高番茄再生芽率的遗传转化体系。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种提升番茄再生芽率的复合基因、植物过表达载体、转基因工程菌和转化方法。本发明所述复合基因能够提高多种番茄品种的再生芽率。

2、本发明提供了一种提升番茄再生芽率的复合基因，所述复合基因含slgrf4的突变基因和slgif1基因；所述slgrf4的突变基因包括slgrf4的同义突变基因mslgrf4或slgrf4的非同义突变基因n-mslgrf4；所述slgrf4的同义突变基因mslgrf4的核苷酸序列如seq idno.2所示，所述slgrf4的非同义突变基因n-mslgrf4的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述slgif1基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。

3、优选的是，所述slgrf4的突变基因和slgif1基因分别通过连接子连接；所述连接子包括如seq id no.5所示的核苷酸序列。

4、优选的是，所述复合基因包括同义突变mslgrf4-slgif1复合基因或非同义突变n-mslgrf4-slgif1复合基因；所述同义突变mslgrf4-slgif1复合基因的核苷酸序列如seq idno.7所示，所述非同义突变n-mslgrf4-slgif1复合基因的核苷酸序列如seq id no.8所示。

5、优选的是，所述番茄的品种包括ailsa craig、money maker和micro-tom中的任意一种。

6、本发明还提供了含上述技术方案所述复合基因的植物过表达载体。

7、本发明还提供了含上述技术方案所述复合基因或上述技术方案所述植物过表达载体的转基因工程菌。

8、本发明还提供了一种提升番茄再生芽率的方法，包括以下步骤：

9、s1、构建含上述技术方案所述复合基因的植物过表达载体，得到含复合基因的植物过表达载体；

10、s2、将所述含复合基因的植物过表达载体转入转基因工程菌中，得到含复合基因的转基因工程菌；

11、s3、将含复合基因的转基因工程菌对番茄进行遗传转化。

12、优选的是，所述植物表达载体包括pcambia2300载体。

13、优选的是，所述转基因工程菌包括gv3101农杆菌。

14、优选的是，步骤s3中，对番茄的子叶进行遗传转化。

15、本发明提供了一种提升番茄再生芽率的复合基因。本发明利用所述复合基因构建植物过表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将携带的复合基因导入不同基因型的番茄材料中，实现了再生芽率的提升，周期短，可转化品种多。本发明打破了基因型对番茄遗传转化的限制，提高了番茄材料的再生芽率，本发明对推动番茄基因组编辑育种，加快番茄新品种培育进程具有重要意义。

16、试验结果表明，实施例以番茄“ailsa craig”为材料，通过农杆菌介导的叶盘转化法转化番茄子叶，获得转化包含slgrf4-slgif1复合基因载体的番茄外植体再生芽率显著高于空载体对照组，再生芽率提高了16.3%，证实slgrf4-slgif1复合基因对番茄外植体再生芽具有促进作用。本发明再以番茄“ailsa craig”为材料，通过农杆菌介导的叶盘转化法转化番茄子叶，获得转化包含同义突变mslgrf4-slgif1复合基因载体的番茄外植体再生芽率显著高于空载体对照组，再生芽率提高了38.8%。进一步对比又显著高于转化slgrf4-slgif1复合基因番茄外植体的再生芽比例，再生芽率进一步提高了22.5%，证实同义突变mslgrf4-slgif1复合基因对番茄外植体芽再生具有更高地促进作用。

17、本发明进一步将包含同义突变mslgrf4-slgif1复合基因的过表达载体，通过农杆菌介导的叶盘转化法转化其他基因型番茄子叶外植体，具体包括money maker和microtom，转化不同基因型番茄外植体再生芽率分别为68.9%和45.6%，相对于空载体对照组再生芽效率分别提升了29.6%和20.3%。证实mslgrf4-slgif1复合基因对多种基因型番茄外植体再生芽率均获得提升。

18、本发明将包含非同义突变n-mslgrf4-slgif1复合基因的过表达载体，通过农杆菌介导的叶盘转化法转化其他基因型番茄子叶外植体，具体包括ailsa craig、money maker和micro tom，结果显示非同义突变n-mslgrf4-slgif1复合基因转化不同基因型的番茄材料再生芽效率分别是44.5%、58.6%和36.8%，相对于空载体对照组再生芽效率分别提升了23.6%、19.3%和11.5%。但相对于同义突变mslgrf4-slgif1复合基因再生芽效率，品种ailsacraig、money maker和micro tom再生芽效率分别降低了15.3%、10.3%和8.8%。证实尽管非同义突变n-mslgrf4-slgif1复合基因对多种基因型番茄外植体芽再生率有提升，但仍低于同义突变mslgrf4-slgif1复合基因的再生芽率。

技术特征：

1.一种提升番茄再生芽率的复合基因，其特征在于，所述复合基因含slgrf4的突变基因和slgif1基因；所述slgrf4的突变基因包括slgrf4的同义突变基因mslgrf4或slgrf4的非同义突变基因n-mslgrf4；所述slgrf4的同义突变基因mslgrf4的核苷酸序列如seq idno.2所示，所述slgrf4的非同义突变基因n-mslgrf4的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述slgif1基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。

2.根据权利要求1所述的复合基因，其特征在于，所述slgrf4的突变基因和slgif1基因分别通过连接子连接；所述连接子包括如seq id no.5所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的复合基因，其特征在于，所述复合基因包括同义突变mslgrf4-slgif1复合基因或非同义突变n-mslgrf4-slgif1复合基因；所述同义突变mslgrf4-slgif1复合基因的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述非同义突变n-mslgrf4-slgif1复合基因的核苷酸序列如seq id no.8所示。

4.根据权利要求1~3任一项所述的复合基因，其特征在于，所述番茄的品种包括ailsacraig、money maker和micro tom中的任意一种。

5.含权利要求1~3任一项所述复合基因的植物过表达载体。

6.含权利要求1~3任一项所述复合基因或权利要求5所述植物过表达载体的转基因工程菌。

7.一种提升番茄再生芽率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体包括pcambia2300载体。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述转基因工程菌包括gv3101农杆菌。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤s3中，对番茄的子叶进行遗传转化。

技术总结本发明属于基因工程技术领域，涉及一种提升番茄再生芽率的复合基因、植物过表达载体、转基因工程菌和转化方法。本发明提供了一种提升番茄再生芽率的复合基因，所述复合基因含SlGRF4的突变基因和SlGIF1基因。基于本发明所述复合基因，构建相应植物过表达载体和转基因工程菌对番茄进行遗传转化，可提高遗产转化效率。本发明打破了番茄再生芽率受限于基因型的限制，填补了没有针对番茄通过生长调节相关因子提升再生芽率方法的空白，对推动番茄基因组编辑育种，加快番茄新品种培育进程具有重要意义。技术研发人员：杨亮,龙海成,马燕勤,周玉洁,李菊,常伟,李志,苗明军,钟建受保护的技术使用者：四川省农业科学院园艺研究所技术研发日：技术公布日：2024/6/13