NX1101蛋白水解酶及其在制备火麻多肽中的应用

本发明涉及生物，具体涉及nx1101蛋白水解酶及其在制备火麻多肽中的应用。

背景技术：

1、工业大麻(cannabis sativa l.)是我国传统“五谷”之一，也是重要的药食同源植物。工业大麻的种子又称为“火麻仁”，富含蛋白质和油脂等养分，是优质的食物和医药资源。我国是世界工业大麻主产国，近年来种植面积最高占全球30％，麻籽产量达、火麻仁衍生产品丰富，其产业发展为助力乡村振兴发挥着重要作用。火麻仁含有约20％-30％的蛋白质和25％-35％的油脂，具有优良的营养特性和生理功能，例如抗氧化、抑菌、调节血管功能、抗糖尿病等功效。大量研究发现，短肽对生物活性贡献突出，经过酶解后产生大量短肽能够显著提高蛋白的营养和生理调节作用。通过酶解获取生物活性肽已成为提升火麻仁蛋白利用效率和多效性健康促进功能的重要策略。然而当前我国火麻仁蛋白以直接利用和粗加工为主，缺乏高效多肽制备技术和对加工产物性质的了解。

2、火麻仁多肽的制备方法有蛋白酶解法、化学合成法以及微生物发酵法等，其中酶解法因其选择性强、安全性好、能耗低、营养损失小等优点被认为是目前最优的制备方法。通过酵母表面展示技术能将功能酶锚定表达在酵母细胞表面制备全细胞催化剂，无需额外的纯化和固定化操作，不产生内毒素，且与游离酶相比具有更好的温度、ph值和有机溶剂稳定性，可重复循环利用等特点，因而更适合在食品领域应用。

3、但当前还是缺乏火麻仁全细胞催化制备相关方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了nx1101蛋白水解酶及其在制备火麻多肽中的应用。

2、本发明提供了nx1101蛋白水解酶及其在制备火麻多肽中的应用。本发明通过研发表面展示nx1101蛋白酶全细胞催化剂，对比了该方法与现有商用碱性蛋白酶的酶解效果，发现新技术能够显著提高酶解效率，尤其是增加短肽含量，表现出明显的提质增效作用，为加快火麻蛋白产业化利用提供了新思路。

3、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

4、本发明提供了nx1101基因，具有：

5、(ⅰ)、如seq id no.1所示的核苷酸序列；或

6、(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

7、(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

8、(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。

9、本发明还提供了表达载体，包括所述nx1101基因以及可接受的载体。

10、在本发明的一些具体实施方案中，所述可接受的载体包括pyd1表面展示载体。

11、在上述研究的基础上，本发明还提供了宿主，包括如下任意项：

12、(1)、所述nx1101基因；和/或

13、(2)、所述表达载体。

14、在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主包括但不限于大肠杆菌和/或酿酒酵母。

15、本发明还提供了如下任意项在制备nx1101蛋白水解酶中的应用：

16、(1)、所述nx1101基因；和/或

17、(2)、所述表达载体；和/或

18、(3)、所述宿主。

19、本发明还提供了nx1101蛋白水解酶，具有：

20、(i)、如seq id no.2所示的氨基酸序列；或

21、(ii)、在如(i)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或

22、(iii)、与如(i)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。

23、本发明还提供了如下任意项在制备火麻多肽全细胞催化剂中的应用：

24、(1)、所述nx1101基因；和/或

25、(2)、所述表达载体；和/或

26、(3)、所述宿主；和/或

27、(4)、所述nx1101蛋白水解酶。

28、本发明还提供了火麻多肽全细胞催化剂，包括如下任意项：

29、(1)、所述nx1101基因；和/或

30、(2)、所述表达载体；和/或

31、(3)、所述宿主；和/或

32、(4)、所述nx1101蛋白水解酶。

33、本发明还提供了如下任意项在制备火麻多肽中的应用：

34、(1)、所述nx1101基因；和/或

35、(2)、所述表达载体；和/或

36、(3)、所述宿主；和/或

37、(4)、所述nx1101蛋白水解酶；和/或

38、(5)、所述火麻多肽全细胞催化剂。

39、本发明还提供了火麻多肽的制备方法，基于脱脂火麻仁籽粕蛋白和如下任意项制备火麻多肽：

40、(1)、所述宿主；和/或

41、(2)、所述nx1101蛋白水解酶；和/或

42、(3)、所述火麻多肽全细胞催化剂。

43、在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法包括如下步骤：

44、步骤1：取脱脂火麻仁籽粕与氢氧化钠溶液混合，超声提取，离心后的上清与hcl混合，获得脱脂火麻仁籽粕蛋白；

45、步骤2：取所述脱脂火麻仁籽粕蛋白与所述宿主、所述nx1101蛋白水解酶或所述火麻多肽全细胞催化剂混合酶解，获得所述火麻多肽。

46、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述脱脂火麻仁籽粕的制备包括如下步骤：

47、步骤(1)、取火麻种子剥壳、低温压榨，获得火麻仁籽粕；

48、步骤(2)、取所述火麻仁籽粕与无水乙醚混合(固液比为1:2)脱脂，45℃烘干，获得所述脱脂火麻仁籽粕。

49、在本发明的一些具体实施方案中，步骤(2)所述脱脂包括：采用脱脂液脱脂，每隔12小时更换一次脱脂液，提取5次。

50、在本发明的一些具体实施方案中，所述脱脂液为无水乙醚。

51、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述脱脂火麻仁籽粕与氢氧化钠溶液的质量体积比为1：10。

52、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述氢氧化钠溶液的ph值为9.5。

53、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述超声的温度为50℃，时间为30min，超声功率200w。

54、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述离心为：4000r/min，15min。

55、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述hcl的浓度为1mol/l。

56、在本发明的一些具体实施方案中，步骤2所述脱脂火麻仁籽粕蛋白与水的的质量体积比为1:20。

57、在本发明的一些具体实施方案中，步骤2所述所述酶解的ph为8.0，温度为50℃。

58、本发明提供了nx1101蛋白水解酶及其在制备火麻多肽中的应用。本发明将源于牛肠道宏基因组文库中的蛋白水解酶nx1101锚定在酿酒酵母菌株(eyb100)表面，并以此重组菌株作为全细胞催化剂制备火麻多肽。酶学性质分析发现，该全细胞催化剂的最适合反应ph值为8.0，在ph8～10之间的酶活稳定性较高，为耐碱性全细胞催化剂；其最适反应温度50℃，在50℃以下时酶活稳定性较高。脱脂火麻蛋白经表面展示表达nx1101的重组酵母全细胞催化剂酶解后，共获得1095个多肽，其中氨基酸数量≤10的短肽数量达140个。全细胞催化剂酶解效率相较常规酶解技术增加6.5倍以上。