一种靶向干细胞的制备方法及应用
- 国知局
- 2024-06-20 10:44:56
本发明属于生物,尤其是涉及一种靶向干细胞的制备方法及应用。
背景技术:
1、大量研究论文报道间充质干细胞(msc)在多种疾病模型以及临床疾病展现出较好的治疗效果,这推动了人们对于干细胞药物的不断探索。然而,在间充质干细胞治疗将近30多年的研究历史中,除了仅有的几个上市药物外,大部分临床结果,并没有想象的那么好,因此成药的干细胞并不多。国际上上市的产品适应症包括移植物抗宿主病(gvhd)、骨关节炎、结肠炎以及下肢缺血,主要集中在发挥间充质干细胞的免疫抑制作用以及抗炎功能。
2、未修饰原始间充质干细胞药效低和不可预测的作用是限制了其临床应用和药物开发进度的主要因素。因此研究者通过不同技术手段在不断改善干细胞作为药物治疗的技术问题和治疗效果。其中干细胞体内靶向归巢能力不足是几乎所有干细胞研究项目治疗亟待解决的问题,目前针对干细胞的靶向性不足主要有以下技术手段:
3、1、通过优化间充质干细胞的培养:然而反复传代容易导致其干性丢失,使细胞的增殖和归巢潜能有所减弱,影响其治疗效果。因此有研究发现,低氧条件下培养能够减少培养时间充质干细胞氧化损伤的累积体外培养诱导处理:培养基添加相应细胞因子孵育msc,从而改善msc迁移和归巢特性,但不同培养环境导致增殖能力异常,细胞干性及功能改变等问题;
4、2、通过基因修饰间充质干细胞:基因修饰的干细胞具有干细胞治疗和基因治疗的双重优势,转染有利于归巢的基因能有效提高间充质干细胞归巢效率。例如,体外研究证实采用慢病毒转染将cxcr4导入间充质干细胞后,msc向sdf-1的迁移能力显著增加。另外,一项研究表明,通过基因工程在间充质干细胞中过表达fgf21,并提高了间充质干细胞向创伤性脑损伤小鼠损伤部位的归巢能力。因此基于基因修饰的策略是干细胞治疗的重要技术手段,另一方面,由于基因修饰带来的安全性问题也给细胞治疗的安全性带来更多挑战。
5、3、表面修饰工程或材料工程:研究人员利用海藻糖、多肽水凝胶等生物材料与细胞联合应用来解决局部定植等问题。另外,类似adc抗体偶联药物,利用干细胞表面特异性的蛋白特性、脂质特性以及聚糖等特性,通过点击化学、糖化学等方式进行细胞表面修饰,这种技术无需繁杂的操作流程,作用直接,更不会对细胞的基因进行改造,具有更高的安全性。因此可以作为功能特化产品开发的有力工具。
6、有研究报道,通过岩藻糖基转移酶ⅶ(fucosyltransferase7,fut7)催化合成唾液酸路易斯寡糖抗原-x(sialyl lewis x,slex)。slex是e-选择素的四糖配体,slex由白细胞表达,并参与炎症期间白细胞粘附到表达e-选择素的内皮细胞。将msc上正常表达的cd44抗原转化为e-选择素/l-选择素配体(hcell)。因此糖基化修饰的干细胞显著增强了其靶向炎症部位能力。
7、但研究显示,msc表面糖基化修饰的hcell结构热稳定性极差,在室温和37℃条件下,很快会被破坏,在室温下,其持续时间为24h,而在37℃,持续时间更短,2小时之后,通过流式细胞仪基本检测不到hcell结构。这种热不稳定些严重影响了作为细胞治疗产品的使用效果。既细胞进入体内之后,糖基化结构被破坏,归巢能力下降,无法达到预期效果。因此如何保护hcell的热稳定性对糖基化修饰的靶向msc功能具有重要意义。
8、四甲基吡嗪是从广泛使用的中药川芎的根茎中分离提纯得到的一种生物活性成分,具有抗炎、抗血栓、抗氧化等功效。发明人发现间充质干细胞在糖基化修饰后,通过添加低浓度范围的四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,tmp)保护液短时预处理,可以显著提高hcell结构的稳定性,在生理温度37℃情况下,间充质干细胞表面糖基化修饰的hcell可稳定24小时,远大于未处理的2h。这种稳定性使得细胞进入体内在血液循环过程中,有更多的时间靶向炎症部位,从而发挥更好的细胞治疗效果。
9、同时四甲基吡嗪的预处理对msc细胞活力、表型及功能上有很好的保持作用,不受催化环境及试剂的影响。
技术实现思路
1、有鉴于此,本发明旨在克服现有技术中的缺陷,提出一种靶向干细胞的制备方法及应用。
2、为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
3、本发明提供了一种含四甲基吡嗪的保护液,该含四甲基吡嗪的保护液中四甲基吡嗪的浓度为10-50μg/ml。
4、进一步,所述的含四甲基吡嗪的保护液中还包含有腺苷和可溶性维生素e;所述的腺苷的浓度为0.05-0.5mg/ml;所述的可溶性维生素e的浓度为0.005-0.02mg/ml。
5、本发明还提供了一种所述的含四甲基吡嗪的保护液的应用,该含四甲基吡嗪的保护液在细胞制备或细胞保藏领域中的应用。
6、本发明还提供了一种靶向干细胞的制备方法,包括如下步骤:
7、(1)细胞培养:将细胞接种于培养容器中,连续传代,细胞融合度达80-90%后收获细胞,消化为单细胞,离心收集细胞沉淀;
8、(2)体外糖基化修饰:洗涤所述的步骤(1)中得到的细胞沉淀,使用催化体系重悬,然后混匀、孵育,得到糖基化细胞;
9、(3)四甲基吡嗪预处理:将所述的步骤(2)中得到的糖基化msc细胞重悬,向其中加入所述的含四甲基吡嗪的保护液,然后置于低温环境中孵育、洗涤细胞,然后得到稳定糖基化修饰msc细胞。
10、进一步,所述的步骤(1)中的细胞为cd44阳性细胞。
11、进一步,所述的cd44阳性细胞为间充质干细胞,所述的间充质干细胞的来源为人体骨髓、脐带、胎盘、牙髓、羊膜、脂肪或脐带血中的一种。
12、进一步,所述的步骤(2)中的催化体系如下:0.1-1ml不含钙镁的hank's平衡盐缓冲液,1-10ug岩藻糖基转移酶,5-20mm hepes缓冲液,0.1-0.5%人血清白蛋白,0.5-5mm二磷酸鸟苷-l-岩藻糖。
13、进一步,所述的步骤(2)中的孵育步骤的温度为37℃,时间为0.5-2小时;所述的步骤(3)中的孵育步骤的温度为2-8℃,时间为15-30分钟。
14、所述的步骤(1)中的消化步骤的消化液为tryple。
15、所述的步骤(3)中的重悬步骤使用的缓冲液为不含钙镁的hank's平衡盐缓冲液种或pbs缓冲液。
16、所述的步骤(3)中的洗涤步骤使用的缓冲液为不含钙镁的hank's平衡盐缓冲液。
17、本发明还提供了一种使用所述的制备方法制备得到的靶向干细胞。
18、本发明还提供了一种所述的靶向干细胞的应用,所述的靶向干细胞在制备治疗炎症的药物中的应用。
19、该方法将msc上正常表达的cd44抗原通过α-1,3-岩藻糖基转移酶转化为e-选择素/l-选择素配体(hcell),增强与炎症部位表达e-选择素的内皮细胞结合能力,改善其迁移特性,提高msc对炎症部位的归巢能力,增强其治疗效果。此外,本发明创新性的在体外通过低浓度短时四甲基吡嗪处理,显著改善了hcell的热稳定性,使其在37℃仍然具有稳定的结构增强细胞归巢能力。四甲基吡嗪不影响细胞表型、免疫原性,以及后续临床应用的安全性。
20、该方法还包括糖基化msc检测步骤:
21、a)表型检测:
22、流式细胞术检测糖基化msc膜表面标志物:cd90,cd73,cd105,hla-abc,hla-dr,cd44,cutaneous lymphocyte antigen(cla);
23、b)与炎症反应内皮细胞靶向结合能力检测:
24、huvec细胞使用tnf-α或lps刺激4-6小时,诱导内皮细胞炎症反应模型;糖基化msc细胞与对照组细胞进行不同荧光染色,共同投入内皮细胞炎症反应模型中,模拟体内血流剪切应力,进行摇床孵育;孵育结束洗掉未结合细胞,荧光显微镜下观察与内皮细胞炎症反应模型结合的情况。
25、相对于现有技术,本发明具有以下优势:
26、本发明所述的靶向干细胞的制备方法过岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase7,fut7)催化合成唾液酸路易斯寡糖抗原-x(sialyl lewis x,slex),将msc上正常表达的cd44抗原转化为e-选择素/l-选择素配体(hcell)。然后在体外通过低浓度短时四甲基吡嗪处理,以获得具有热稳定的靶向炎症部位的工程化间充质干细胞,四甲基吡嗪不影响细胞表型、免疫原性,以及后续临床应用的安全性。
27、本发明所述的靶向干细胞的制备方法与现有技术手段相比,不引入外源基因,不存在安全性风险;该方法制备工艺简单,操作方便,适合规模化生产;该方法基于岩藻糖基化反应,制备工艺及原料简单,不影响细胞活性、表型及功能,修饰效率高,修饰于膜上的hcell结构与炎症部位e-选择素结合特异性强,显著提高靶向炎症部位的能力;使用低浓度四甲基吡嗪,对岩藻糖基化修饰的hcell结构具有显著保护作用,在生理体温37℃条件下更稳定、不易被分解破坏,延长靶向炎症部位能力时效。
本文地址:https://www.jishuxx.com/zhuanli/20240619/249.html
版权声明:本文内容由互联网用户自发贡献,该文观点仅代表作者本人。本站仅提供信息存储空间服务,不拥有所有权,不承担相关法律责任。如发现本站有涉嫌抄袭侵权/违法违规的内容, 请发送邮件至 YYfuon@163.com 举报,一经查实,本站将立刻删除。
下一篇
返回列表