一种提升人参细胞中PPD型人参皂苷含量的PgMYC2基因及其应用

本发明涉及基因工程，具体涉及一种提升人参细胞中ppd型人参皂苷含量的pgmyc2基因及其应用。

背景技术：

1、人参（panax ginseng c. a. meyer）作为中国传统中药材，因其具有多种生物活性成分和药用价值而备受关注。其中，人参皂苷是人参的主要药效成分之一，其独特的药理作用使得人参在抗肿瘤、抗衰老、增强免疫力和保肝护肝等方面具有广泛的应用前景。目前已经从人参中分离并鉴定出50余种的人参皂苷，这些人参皂苷根据结构特点分为原人参二醇（protopanaxadiol，ppd）型：如人参皂苷rb1、rb2、rc、rd、rg3、rh2和f2等；原人参三醇（protopanaxatriol，ppt）型：如人参皂苷re、rf、rg1、rg2、rh1等；齐墩果酸（oleanolicacid）型：如人参皂苷ro等。然而，天然人参皂苷的含量相对较低，且提取纯化过程复杂，限制了其大规模应用和商业化发展。因此，如何通过基因工程手段提高人参皂苷的含量，尤其是特定类型的人参皂苷的含量，成为当前研究的热点。研究发现，ppd型人参皂苷中的rb1、rd、rg3、rh2和f2等在增强免疫力、抗衰老、抑制癌细胞增殖、保护神经和保肝护肝等方面具有独特的药理活性。然而，ppd型人参皂苷在人参中的含量极低，且其生物合成途径复杂，受到多种酶和基因的调控。因此，深入了解ppd型人参皂苷的生物合成机制，以及如何通过基因工程手段调控其合成，对于提高人参皂苷的含量和产量具有重要意义。

2、茉莉酸类物质（jasmonates，jas）是植物受外界刺激后体内反应最快并且起全局调控作用的防御性激素类信号分子，其通过信号转导作用调控植物生长发育和胁迫应答等生物过程，从而激发植物体内防御性次生代谢产物如人参皂苷等的合成。在茉莉酸信号通路中，myc转录因子作为bhlh（basic helix-loop-helix）转录因子的一个亚族，是茉莉酸信号途径的关键调控因子。植物细胞中茉莉酸浓度较低时，转录抑制因子 jaz 与转录激活因子 myc2 结合，抑制其活性从而阻止下游基因的转录；当植物受到外界胁迫时，细胞中合成和积累茉莉酸，并运输到细胞质中通过茉莉酸-异亮氨酸合成酶催化合成ja-ile，其可促进jaz蛋白与scfcoi1受体复合物结合，使jaz蛋白泛素化并被26s蛋白酶体降解，从而解除jaz对myc2转录活性的抑制，进一步影响下游基因的表达。myc2转录因子所介导的转录调控过程是整个茉莉酸信号通路的核心事件。研究发现，myc转录因子能够通过结合到所要调控的次生代谢产物生物合成的酶基因上游的顺式调节元件，调节其合成酶基因的表达，从而调控这些活性成分的生物合成。

3、然而，jas在促进次生代谢产物的合成与积累的同时，也可能会对细胞生长产生一定的抑制作用，从而影响次生代谢产物的产量。为了解决这个问题，可以尝试通过控制ja激活的myc转录因子，在提高次生代谢产物的含量同时减少对细胞生长的影响，进而提供次生代谢产物的产量。目前尚不清楚pgmyc2基因在人参细胞中的作用，关于人参pgmyc2基因的克隆和应用于人参皂苷生物合成调控的研究未见报道。如何通过pgmyc2实现对人参细胞持久高效的合成人参皂苷的调控，对于提高人参皂苷的含量有潜在的应用价值。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明首先提供了一种提升人参细胞中ppd型人参皂苷含量的pgmyc2基因及其应用，利用pgmyc2作为ja信号通路中的关键转录因子，进而实现利用其激活下游ja响应基因的表达，特别是ppd型人参皂苷生物合成酶基因的表达，最终实现调节人参皂苷的合成。通过瞬时过表达pgmyc2基因，使得细胞中pgmyc2表达水平提高，从而与ja响应的多种基因的启动子结合，启动其表达，诱导人参皂苷积累，该方法通过pgmyc2实现对人参细胞持久高效合成人参皂苷进行调控，对于提高人参皂苷的含量有潜在的应用价值。

2、为达到上述目的，本方案首先提供了一种提升人参细胞中ppd型人参皂苷含量的pgmyc2基因，所述pgmyc2基因的序列如seq id no.1所示。

3、作为优选，所述pgmyc2基因的引物序列如seq id no.2和seq id no.3所示。

4、作为优选，所述pgmyc2基因编码的蛋白氨基酸序列如seq id no.4所示。

5、作为优选，所述pgmyc2基因的获得方法为：提取经茉莉酸-异亮氨酸偶联物（ja-ile）或茉莉酸甲酯（meja）诱导后的人参发根总rna，经过反转录合成cdna，并根据ja-ile和meja诱导的人参转录组测序所获得的基因序列信息设计体外扩增的序列如seq id no.2和seq id no.3所示的特异性引物，通过pcr扩增获得pgmyc2基因。

6、作为优选，所述ja-ile或meja诱导的时间为12-72h。

7、基于一个总的发明构思，本方案还提供了一种提升人参细胞中ppd型人参皂苷含量的pgmyc2基因的重组载体，所述重组载体的构建方式为：以pgmyc2基因的开放读码框作为过表达序列，将该过表达序列连接至植物表达载体pcambia1302中制得。

8、基于一个总的发明构思，本方案还提供了一种提升人参细胞中ppd型人参皂苷含量的pgmyc2基因或提升人参细胞中ppd型人参皂苷含量的pgmyc2基因的重组载体在提升人参细胞中人参皂苷含量的应用。

9、作为优选，所述应用方法为：通过过表达所述pgmyc2基因，提高人参细胞中ppd型人参皂苷含量。

10、本方案在提高人参细胞中人参皂苷的含量的机理为：

11、本发明采用ja-ile或meja诱导的人参发根基因差异表达的转录组测序方法，发现人参myc转录因子家族基因，并从中筛选出pgmyc2基因，通过qrt-pcr分析显示pgmyc2基因和ppd型人参皂苷合成途径中上游基因（pgse和pgdds）和下游酶基因（pgugt74ae2和pgugt71a27）均受ja-ile和meja的诱导表达，并且其表达模式与ppd型人参皂苷的积累非常相似。

12、本发明提供了一种利用pgmyc2作为ja信号核心转录因子的能力进而激活多种ppd型人参皂苷合成酶基因表达，实现利用其调节ppd型人参皂苷的合成，通过瞬时过表达pgmyc2基因，使得其在细胞中诱导人参皂苷积累。因此，该方法能实现利用其促进ppd型人参皂苷的合成，最终提高ppd型人参皂苷的含量。

13、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

14、本发明提供的提高人参皂苷含量的方法是pgmyc2基因在瞬时过表达的人参愈伤组织中表达，达到提高ppd型人参皂苷含量的目的，该基因及其编码的蛋白是一种切实可行的提高人参中ppd型人参皂苷含量的方法。

15、（2）本发明通过构建了pgmyc2基因植物过表达载体，再通过农杆菌a4介导转化人参愈伤组织，与对照人参愈伤组织相比，pgmyc2基因瞬时过表达的人参愈伤组织中人参皂苷含量显著提高，ppd人参皂苷含量最高可以提升5.96倍。由此说明，利用过表达pgmyc2基因能够显著提高人参皂苷的含量，是一种有效的技术手段。