苯乙烯单加氧酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及酶催化领域，具体而言，涉及一种苯乙烯单加氧酶突变体及其应用。

背景技术：

1、大位阻手性环氧化物（含有苯环和/或三元醚结构，其中苯环上有多个取代或三元醚结构两侧任意一侧的基团的位阻大于甲基的一类化合物）是有机合成中一类非常重要的手性合成砌块，在医药、农药、香料和精细化学品工业等方面都有着重要的应用价值。对于烯烃底物的环氧化，用贵金属催化剂和具有mfi结构的结晶性钛硅酸盐催化剂作为双催化剂制备，但化学催化反应条件苛刻、选择性低、副产物多，并且使用的重金属催化剂成本高，环境不友好。目前关于合成大位阻手性环氧化物的相关报道较少，而且无法取得令人满意的结果。（jaan pesti, chien-kuang chen, lori spangler, albert j. delmonte,serge benoit, derek berglund, jeffrey bien, paul brodfuehrer, yeung chan,elisabeth corbett, carrie costello, paul demena, robert p. discordia, wendeldoubleday, zhinong gao, stephane gingras, john grosso, oscar haas, davidkacsur, chiajen lai, simon leung, melanie miller, jale muslehiddinoglu, ninanguyen, jun qiu, martina olzog, emily reiff, dominique thoraval, michaeltotleben, dale vanyo, purushotham vemishetti, john wasylak, and chenkou wei.the process development of ravuconazole: an efficient multikilogram scalepreparation of an antifungal agent. organic process research & development.2009, 13(4): 716-728）中公开了一种大位阻手性环氧化物中间体的合成方法，但是路线较长，需要对活泼基团进行上保护和脱保护，反应条件苛刻、选择性差且工艺复杂。

2、苯乙烯单加氧酶催化合成大位阻手性环氧化物提供了一种经济、绿色、高效的合成思路。不过，天然的苯乙烯单加氧酶对大位阻烯烃底物的催化存在局限性，目前没有能高效合成大位阻手性环氧化物的苯乙烯单加氧酶。因此，寻求一种活性高和/或底物选择范围大的苯乙烯单加氧酶是大位阻手性环氧化物高效合成的关键，也是一个亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种苯乙烯单加氧酶突变体及其应用，以解决现有技术中苯乙烯单加氧酶活性低的问题。

2、为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种苯乙烯单加氧酶突变体，包括（a）具有seq id no：1所示的氨基酸序列的蛋白质；（b）在（a）中的氨基酸序列的如下至少一个位点：i206、s107、p54、n307、s178、l310、l275、l204、w86、e202、h392、e221、r53、v83、a101、a102、r157、f180、i194、l218、a232、g273、q277、q313、v388或a52，经过氨基酸突变且具有苯乙烯单加氧酶功能的蛋白质；或（c）与（a）或（b）中任一项限定的氨基酸序列具有80%以上同源性且具有苯乙烯单加氧酶功能的蛋白质。

3、进一步地，（b）的氨基酸突变选自如下至少一个位点：a52n或a52q或a52f或a52h或a52p或a5s、r53n或r53g或r53h、p54l或p54s或p54f或p54k、v83s或v83a或v83g或v83f或v83p、w86f或w86q或w86a或w86s或w86k或w86g或w86h或w86y或w86m、a101s或a101r或a101g或a101d或a101f或a101m或a101k、a102p或a102m或a102f、s107a或s107e或s107y或s107k或s107g或s107v、r157f或r157y或r157q或r157w或r157n或r157c或r157p或r157d、s178f或s178n或s178w或s178c或s178i、f180y或f180i或f180s或f180e、i194f或i194h或i194g或i194d或i194w、e202s或e202a或e202q、l204c或l204a或l204s或l204f、i206v或i206a或i206l或i206s或i206q或i206p或i206h、l218i或l218q或l218s或l218g或l218w或l218d或l218a或l218h或l218e、e221n或e221a或e221f或e221c或e221g或e221i、a232y或a232g或a232s或a232q或a232v或a232c或a232m、g273s或g273a或g273h或g273f、l275f或l275a或l275t或l275y或l275h或l275g或l275e或l275q或l275m或l275s、q277s或q277g或q277p或q277f、n307c或n307d或n307w或n307y、l310m或l310a或l310f或l310c或l310s或l310i或l310h或l310r或l310q或l310v、q313m或q313a或q313p或q313k或q313s、v388a或v388f或h392n或h392k或h392a或h392s或h392c或h392v；其中，数字前字母代表原始氨基酸，数字后字母代表突变氨基酸；优选地，（c）中，与（a）或（b）中限定的氨基酸序列具有85%以上，优选90%以上，更优选95%以上，进一步优选99%以上同源性且具有苯乙烯单加氧酶功能的蛋白质。

4、进一步地，苯乙烯单加氧酶突变体的突变包括如下任意一种氨基酸突变：i206v、i206a、i206l、i206s、i206q、i206p、i206h、s107a、s107e、s107y、s107k、s107g、s107v、r157q、r157c、r157p、r157d、r157q、i194f、i194h、i194g、i194d、i194w、p54l、p54s、p54f、p54k、r157q、r157y、r157w、r157f、r157n、n307c、n307w、n307y、n307d、l275f、l275a、l275t、s178f、s178n、s178w、r53n、r53g、r53h、f180y、f180e、f180s、a52n、a52q、a52f、a52h、a52p、g273s、g273a、g273h、g273f、i206v+s107a、i206v+s107e、i206v+s107k、i206v+r157q、i206v+r157y、i206v+r157w、i206v+r157f、i206v+i194f、i206v+i194d、i206v+i194w、i206v+p54l、i206v+p54s、i206v+p54f、i206v+r157q、i206v+r157y、i206v+r157f、i206v+n307c、i206v+n307w、i206v+n307y、i206v+n307d、i206v+l275f、i206v+l275a、i206v+l275t、i206v+s178f、i206v+s178n、i206v+s178w、i206v+r53n、i206v+r53g、i206v+r53h、i206v+f180y、i206v+f180e、i206v+f180s、i206v+a52n、i206v+a52q、i206v+a52f、i206v+a52h、i206v+a52p、i206v+g273s、i206v+g273a、i206v+g273h、i206v+g273f、i206v+s107a+p54l、i206v+s107a+p54s、i206v+s107a+g273a、i206v+s107a+g273f、i206v+s107a+a52p、i206v+s107a+f180s、i206v+s107a+r53n、i206v+s107a+l275t、i206v+s107a+n307y、i206v+s107a+r157f、i206v+s107a+i194d、i206v+s107a+p54l+n307c、i206v+s107a+p54l+n307w、i206v+s107a+p54l+l275a、i206v+s107a+p54l+l275f、i206v+s107a+p54l+i194w、i206v+s107a+p54l+r157f、i206v+s107a+p54l+i194d、i206v+s107a+p54l+l275t、i206v+s107a+p54l+a52p、i206v+s107a+p54l+r53h、i206v+s107a+p54l+n307d、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f、i206v+s107a+p54l+n307c+s178c、i206v+s107a+p54l+n307c+s178i、i206v+s107a+p54l+n307c+r53n、i206v+s107a+p54l+n307c+f180y、i206v+s107a+p54l+n307c+f180i、i206v+s107a+p54l+n307c+a52n、i206v+s107a+p54l+n307c+a52s、i206v+s107a+p54l+n307c+g273s、i206v+s107a+p54l+n307c+g273a、i206v+s107a+p54l+n307c+g273h、i206v+s107a+p54l+n307c+i194f、i206v+s107a+p54l+n307c+i194h、i206v+s107a+p54l+n307c+i194d、i206v+s107a+p54l+n307c+i194w、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310i、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310a、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310h、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310r、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310q、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310v、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310c、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310f、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+q313m、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+q313m、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+q313a、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+q313p、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+q313k、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+q313s、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l275y、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l275a、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l275g、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l275h、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l275e、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310s、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310a、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310c、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310i+l275y、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310i+l275q、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310i+l275m、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310i+l275a、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310i+l275s、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310i+a232y、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310i+a232g、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310i+a232s、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310i+a232q、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310i+a232v、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310i+a232c、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310i+a232m、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310i+v388a、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310i+v388f、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310s+l275y、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310c+l275y、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310f+l275y、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310a+l275y、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204a、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204s、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204f、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+w86f、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+w86q、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+w86a、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+w86s、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+w86k、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+w86g、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86f、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86a、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86q、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86g、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86h、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86y、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+l218q、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+l218i、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+l218s、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+l218g、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+l218w、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+l218d、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+l218i、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+l218a、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+l218h、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+l218g、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+l218s、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+l218e、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202a、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202q、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+a101s、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+a101r、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+a101g、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+l218i+a101s、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+l218i+a101d、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+l218i+a101f、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+l218i+a101m、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+a101s、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+a101g、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+a101k、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392k、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392a、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392s、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392c、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392v、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+e221n、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+e221a、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+e221f、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+e221c、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+e221g、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+e221i、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+l310f、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+l310a、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+l310p、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+l310r、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+q277s、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+q277g、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+q277p、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+q277f、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+a102p、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+a102m、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+a102f、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+v83f、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+v83p、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+a102p+v83f、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+a102p+v83a、i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+a102p+v83g或i206v+s107a+p54l+n307c+s178f+l310m+l275y+l204c+w86m+e202s+h392n+a102p+v83s。

5、为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种dna分子，该dna分子编码上述的苯乙烯单加氧酶突变体。

6、为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种重组质粒，该重组质粒连接上述dna分子。

7、为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞内转化有上述重组质粒。

8、为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种手性环氧化物的制备方法，该制备方法包括利用上述的苯乙烯单加氧酶突变体与式i所示的烯烃底物进行催化反应，得到式所示的上述手性环氧化物；式i；式；其中，上述r1选自f、cl、br、甲氧基或取代或非取代的 c1-c4的烷基，当且有取代基时，取代基选自羟基或aco-；上述r2选自h、苯基、、c3-c6的杂烷基或取代或非取代的 c1-c6的烷基，当且有取代基时，取代基选自，其中，“*”表示上述r2在上述烯烃底物或上述手性环氧化物中的连接位置；上述r3选自h、c3-c6的杂烷基、取代或非取代的 c1-c6的烷基、、、或，其中，“*”表示上述r3在上述烯烃底物或上述手性环氧化物中的连接位置。

9、进一步地，上述烯烃底物选自：

10、、、、、 、、、 、 或。

11、进一步地，上述进行催化反应的反应体系包括：上述苯乙烯单加氧酶突变体、上述烯烃底物、还原酶styb、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖、fad、nad+及ph7~9的50~200mm磷酸缓冲液。

12、进一步地，上述反应体系中的上述烯烃底物与上述苯乙烯单加氧酶的质量比按g:g计为1:10~50；优选地，上述苯乙烯单加氧酶的用量为0.02g~10g。

13、进一步地，上述进行催化反应的反应温度为20℃~40℃，优选为25℃~35℃。

14、应用本发明的技术方案，以来源于streptomyces exfoliatus的苯乙烯单加氧酶stya（seq id no：1）为母本，进行了单点定点突变、饱和突变或组合突变等蛋白质工程改造，获得了活性高且能高效生产大位阻手性环氧化物的苯乙烯单加氧酶突变体。