用于空间转录组学分析的生物芯片的制作方法

本技术涉及生物学与医疗器械领域。具体的，本技术涉及制备用于分析生物样品的细胞的核酸信息的芯片，所述芯片适合用于分析生物组织样品的空间转录组学信息。

背景技术：

1、基因表达分析的最新发展，为利用微阵列或rna测序评估组织的空间转录组提供了可能，然而，已知的用于空间转录组分析的方法和芯片仍然存在一些尚未解决的问题，例如技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、芯片探针阵列的每一个阵点的面积尺寸与探针分布不均匀，导致获得的信息的均一性存在问题，对其应用造成很大的影响。

技术实现思路

1、本实用新型提供了用于分析生物样品的核酸信息的芯片。

2、在本实用新型的其中一个方面，提供了一种用于分析生物样品的核酸信息的芯片，其中所述芯片的表面具有用于形成阵列的探针，所述探针阵列包括正交的行和列，所述阵列的阵点中的探针各具有不同的序列，其中所述探针包括第一条形码和第二条形码，所述探针阵列的每一行探针具有相同的第一条形码以及每一列的探针具有相同的第二条形码；每一行探针具有的第一条形码各不相同以及每一列探针具有的第二条形码各不相同。

3、本发明中，“探针”为本领域公知和使用的常用术语，通常为一种核酸型探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(dna或rna)。如《分子生物学》(郜金荣主编，2011年化学工业出版社出版)中描述的，核酸型探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，从而把目的基因显示出来。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件:①是单链，若为双链，必须先行变性处理。②带有容易被检测的标记。

4、承载核酸探针的芯片，也称为基因芯片或阵列(array)或微阵列(microarray)，是指将数以百计或者数以千万计的核酸探针固定于固相支持物表面，从而产生二维探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速、并行和高效的检测及分析。承载核酸探针的芯片，可供选择的固相载体包括硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等。

5、在本实用新型的其中一个方面，所述芯片中每个阵点的宽度为约5-100μm，以及阵点的尺寸均一性偏差小于10％。

6、所述阵列中的探针各具有不同的序列，可用于体现所述探针的空间位置。

7、在本实用新型的其中一个方面，所述芯片的表面具有用于与核酸分子结合的修饰层和形成阵列的探针，所述修饰层和所述探针通过化学键方式连接。如本领域公知的，在芯片表面，即核酸探针的支持物表面通过化学修饰方法衍生出具有例如羟基或氨基等可以与核酸形成共价连接的基团，由此形成连接芯片固相载体底层和探针的修饰层或称为修饰材料层。

8、在本实用新型的其中一个方面，所述探针包括第一条形码和第二条形码。在本实用新型的其中又一个方面，所述探针阵列的每一行探针具有相同的第一条形码以及每一列的探针具有相同的第二条形码；每一行探针具有的第一条形码各不相同以及每一列探针具有的第二条形码各不相同。

9、在本实用新型的其中又一个方面，所述探针阵列中的每个探针的序列从5’端到3’端包括所述芯片表面连接子核酸、第一条形码、第二条形码、用于识别和结合生物样品中的目标核酸的捕获片段。在本实用新型的其中又一个方面，所述探针阵列中的每个探针的序列包括5’端的用于扩增反应的引物片段。

10、在本实用新型的其中又一个方面，所述探针阵列中的每个探针的序列还包括唯一分子标识符(umi)。

11、在本实用新型的其中一个方面，所述芯片的阵点的探针密度为约103-104个μm2。

12、在本实用新型的其中一个方面，所述芯片的阵点具有的探针的均一性偏差小于20％，优选小于10％，更优选小于6％。

13、在本实用新型的其中一个方面，所述芯片的阵点的尺寸均一性偏差小于5％，优选小于2％。

14、在本实用新型的其中一个方面，所述芯片中每个阵点的宽度为约5-100μm，优选为约10-50μm，最优选为约10-30μm，例如为约25μm或约10μm。

15、在本实用新型的其中一个方面，所述芯片中相邻阵点的距离为约2-100μm，优选为约5-50μm，最优选为约5-30μm，例如为约10μm或15μm。

16、在本实用新型的其中一个方面，所述芯片的宽度为约0.5-50mm，优选为约1-40mm，最优选为约5-20mm。“宽度”一般是指芯片的最大宽度方向上的尺寸。例如“40mm的芯片”可包括40mm x 40mm或40mm x 20mm等的芯片。

17、在本实用新型的其中一个方面，所述用于分析生物样品的核酸信息的芯片可通过以下方法制备得到，所述方法包括以下步骤：

18、a.通过多条平行设置的微流道将第一组条形码核酸以化学键连接方式固定在芯片表面，形成第一方向的多条第一条形码带，所述第一组条形码核酸中包括多种具有不同条形码序列的第一条形码核酸，每条第一条形码带上固定一种第一条形码核酸，且每条第一条形码带上固定的第一条形码核酸具有不同的条形码序列；

19、b.通过多条平行设置的微流道将第二组条形码核酸沿第二方向施加到芯片表面的具有第一方向的所述多条第一条形码带上，形成多条第二条形码带，所述第二组条形码核酸中包括多种具有不同条形码序列的第二条形码核酸，每条第二条形码带上具有一种第二条形码核酸，且每条第二条形码带上固定的第二条形码核酸具有不同的条形码序列；

20、c.在使得第一条形码核酸和第二条形码核酸发生连接反应的条件下，在所述多条第一条形码带与所述多条第二条形码带产生交叉的芯片表面将第二条形码核酸与第一条形码核酸连接，形成探针，所述探针构成阵列的阵点，每个阵点具有一种序列相互不同的探针。

21、在本实用新型的其中一个方面，所述方法中采用具有多条平行设置的微流道的微流道装置将所述第一组条形码核酸或第二组条形码核酸输送和固定在芯片表面，其中所述微流道与芯片表面接触的一面可容溶液或溶液中的核酸通过。

22、在本实用新型的其中一个方面，所述方法中在所述微流道设备的每一条微流道中加入含有不同条形码序列的第一组条形码核酸或第二组条形码核酸。

23、在本实用新型的其中一个方面，所述方法中所述第一组条形码核酸中的第一条形码核酸包括第一条形码片段；优选的，所述第一条形码核酸在5’端还具有用于扩增反应的引物片段。

24、在本实用新型的其中一个方面，所述方法中所述第一组条形码核酸中的第一条形码核酸在5’端具有用于与芯片表面连接的基团。

25、在本实用新型的其中一个方面，其中所述第二组条形码核酸中的第二条形码核酸包括3’端的用于识别和结合生物样品中的目标核酸的捕获片段(例如为识别和结合mrna或cdna的片段，例如为poly-t序列)和第二条形码片段。

26、在本实用新型的其中一个方面，所述方法中所述第二组条形码核酸中的第二条形码核酸还具有唯一分子标识符(umi)。

27、在本实用新型的其中一个方面，所述方法中所述第一条形码核酸的3’端具有用于通过一个单链连接核酸与第二条形码核酸连接的第一连接片段，所述第二条形码核酸的5’端具有用于通过所述单链连接核酸与第一条形码核酸连接的第二连接片段，所述第一连接片段和第二连接片段分别与所述单链连接子核酸的两端的序列反向互补。

28、在本实用新型的其中一个方面，所述方法中步骤c中形成的探针包括3’端的用于识别和结合生物样品中的目标核酸的捕获片段，以及第一条形码片段和第二条形码片段。优选的，所述探针在5’端还具有用于扩增反应的引物片段。

29、在本实用新型的其中一个方面，所述方法中所述第一组条形码核酸中的每一种第一条形码核酸的条形码片段的序列是指定的，和/或所述第二组条形码核酸中的每一种第二条形码核酸的条形码片段的序列是指定的。

30、在本实用新型的其中一个方面，所述方法中所述探针的第一条形码片段和第二条形码片段的序列是指定的。

31、在本实用新型的其中一个方面，所述方法中步骤a中，所述第一组条形码核酸的核酸以化学键连接方式固定在芯片表面上。化学键连接方式例如为选自氨基、醛基、环氧基、异硫氰酸基、巯基、硅烷参与的化学键的任意一种，例如为氨基-醛基反应等。芯片的表面可以通过表面化学反应用氨基、醛基、环氧基、异硫氰酸基、巯基、硅烷等活性基团等进行包被；所述第一组条形码核酸的核酸与芯片表面连接的一端(通常为5’端)则具有与包被的活性基团形成化学键的基团。

32、在本实用新型的其中一个方面，所述方法中步骤a和步骤b中所述平行设置的微流道的各条微流道的高度为约5-28μm，优选为约10-15μm，例如为约10μm或约15μm。

33、在本实用新型的其中一个方面，所述方法中步骤a和步骤b中所述平行设置的微流道的各条微流道的宽度为约5-100μm，优选为约10-50μm，最优选为约10-30μm，例如为约25μm或约10μm。

34、在本实用新型的其中一个方面，所述方法中步骤a和步骤b中所述平行设置的微流道的各条相邻微流道之间的间距为约2-100μm，优选为约5-50μm，最优选为约5-30μm，例如为约10μm或15μm。

35、在本实用新型的其中一个方面，所述方法制备得到的芯片的阵点的探针密度为约103-104个μm2。

36、本实用新型可用于分析生物组织样品的空间转录组学信息的方法，所述方法包括将前述芯片的阵列与组织样品接触。适于本实用新型的“组织样品”包括从受试者获得，固定，切片并且安装在平面表面的组织。组织样品可以是福尔马林固定的石蜡包埋(ffpe)组织样品或新鲜组织样品或冷冻组织样品等。本实用新型的方法可以在染色组织样品之前或之后进行。例如，在苏木精和曙红染色之后，组织样品可以按照本文提供的方法进行空间分析。方法可以包括分析样品的组织学(例如使用苏木精和曙红染色)，然后空间分析组织。组织切片用福尔马林固定和石蜡包埋(ffpe)通常包括将从受试者获得的组织在甲醛(例如磷酸盐缓冲盐水中的3％

37、-5％甲醛)或bouin溶液中固定，包埋到蜡中，切成薄切片，然后安装在平面表面，如显微镜载玻片中的生检。

38、本实用新型提供的芯片可适用的方法在将组织切片与芯片上的探针阵列接触，阵列上的探针可识别和结合组织中的细胞的核酸，特别是mrna。后续的分析包括逆转录和扩增等，并且可通过高通量下一代测序(ngs)或合成测序(sbs)进行分析。

39、本实用新型的制备得到的芯片可用于对组织样品，特别是组织薄切片进行细胞内含分子的分析，包括对核酸和蛋白的分析，例如通过pcr、质谱法、新一代测序、或elisa进行分析，获得其表达和空间信息。

40、在本实用新型的其中一个方面，所述生物样品为来自受试者的组织样品，例如为手术切除组织样品，优选为通过显微切片术加工得到的组织薄切片。在本实用新型的其中一个方面，所述组织样品经过固定和包埋(例如包埋在石蜡中)，以及附着在支持物例如玻片上。

41、本实用新型提供的芯片可适用于对所述组织薄切片进行形态分析和/或组织学分析，该组织学分析是通过h&e染色、ihc染色、ish染色、以及fish染色进行。

42、在本实用新型的其中一个方面，对该一种或多种生物分子进行分析是通过pcr、质谱法、新一代测序、或elisa进行。

43、在本实用新型的其中一个方面，受试者选自动物、农场动物、宠物、人类受试者。

44、在本实用新型的其中一个方面，分析物进一步包括非人细胞、人细胞、非天然蛋白质、核酸、或小分子、染料、病毒、细菌、寄生虫、原生动物或化学物质中的一种或多种。小分子包括半抗原、肽标签、蛋白质标签、荧光标签、核酸标签、及其组合。

45、在本实用新型的其中一个方面，所述芯片可用于分析样品中标记物的定量和/或定性数据。该标记物包括dna、蛋白质、rna、脂质、细胞器、代谢物、或细胞。该蛋白质可包括修饰，所述修饰选自下组，该组由以下各项组成：乙酰化、adp-核糖基化、酰化、adp-核糖基化、酰胺化、共价附接黄素、共价附接血红素、共价附接核苷酸或核苷酸衍生物、共价附接脂质或脂质衍生物、共价附接磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、gpi锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、精氨酰化、以及泛素化。该标记物包括基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性(snp)，基因组snp，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质和/或细胞器的差异表达。该标记物包括单个核苷酸位置；基因内区域或基因间区域；外显子或内含子、或其片段；编码区或非编码区；启动子、增强子、5'非翻译区(5'utr)、或3'非翻译区(3'utr)、或其片段；cdna或其片段；snp；体细胞突变、种系突变、或两者；点突变或单一突变；缺失突变；框内缺失、基因内缺失、全基因缺失；插入突变；基因内插入；倒位突变；染色体内倒位；连锁突变；连锁插入突变；反转重复突变；串联重复；染色体内串联重复；易位；染色体易位，非相互易位；重排；基因组重排；一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5'-或3'-utr、或其组合。其中与正常的健康组织或细胞相比，在癌组织或癌细胞中该标记物包括对改变的氨基酸序列进行编码的改变的核苷酸序列、染色体易位、染色体内倒位、拷贝数变化、表达水平变化、蛋白质水平变化、蛋白质活性变化、或甲基化状态变化。其中可通过单细胞测序、单核测序、流式细胞术、免疫组织化学染色、苏木精和伊红染色、全基因组测序、高通量测序、质谱法、dna微阵列、或其组合对该标记物进行测量。

46、本实用新型的芯片可用于分析组织样品。该组织样品包括选自以下项的组的样品：一种或多种恶变前或恶性细胞、来自实体瘤的细胞、软组织肿瘤或转移灶、来自手术边缘的组织或细胞、组织学正常组织、一种或多种循环肿瘤细胞(ctc)、正常邻近组织(nat)、来自患肿瘤或处于患肿瘤风险的相同受试者的血液样品、或ffpe样品。