一种用于筛选具有固有免疫增强性能菌株的细胞平台及其应用的制作方法

本发明涉及医药，具体涉及一种用于筛选具有固有免疫增强性能菌株的细胞平台及其应用。

背景技术：

1、益生菌是一类定植于肠道、生殖道系统内，能够对人和动物产生有益作用的活性微生物。它可以促进机体肠道健康，改善腹泻性疾病和营养代谢性疾病。而且，益生菌可以刺激人体黏膜免疫系统产生ⅰ型干扰素增强固有免疫并发挥抗感染、免疫调节作用，尤其是抵抗肠道病毒、呼吸道病毒等的感染。聚肌胞poly(i:c)是由聚肌苷酸和聚胞苷酸通过碱基互补配对形成的双链rna，可以模拟病毒的dsrna结构，高效诱导的干扰素生成。现有技术中未见有关于能够用于筛选具有固有免疫增强性能菌株(例如益生菌)的细胞平台(方法)及其应用。

技术实现思路

1、基于此，本发明提供了一种在细胞水平筛选具有固有免疫增强性能菌株的方法，该方法包括下列步骤：

2、(1)使用细胞培养基对在体外可进行培养的人或动物上皮细胞进行培养至单层细胞；

3、(2)将菌株溶液和第一细胞培养液加入该上皮细胞进行培养一段时间，弃去含菌的细胞培养液，洗涤，加入第二细胞培养液；

4、(3)加入多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐(poly(i:c))和转染试剂至该上皮细胞中，使该多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐转染进入该上皮细胞内进行刺激；以及

5、(4)收取该上皮细胞，检测ifn-β的基因和蛋白表达水平，和/或检测干扰素刺激基因的表达水平。

6、进一步地，该细胞培养基选自以下的一种或多种：dmem培养基、mem培养基和prmi1640培养基。

7、进一步地，该第一细胞培养液包括该细胞培养基和胎牛血清。

8、进一步地，该第二细胞培养液包括该第一细胞培养液，以及青霉素和/或链霉素。

9、进一步地，该上皮细胞为肺癌上皮细胞。

10、进一步地，该肺癌上皮细胞为a549-ace2细胞、a549细胞、calu3细胞、hcc-827细胞、llc-1细胞、d17细胞、gct细胞、mor细胞或nci系列细胞。

11、进一步地，在步骤(1)之后，在步骤(2)之前，该方法进一步包括该菌株溶液的前处理步骤：将菌株从保菌管中取出并活化约24小时之后，刮取部分菌落于液体培养基中摇菌、离心、洗涤和悬浮，得到该菌株溶液。

12、进一步地，在步骤(2)中，该菌株溶液的剂量为moi＝50～150。

13、进一步地，在步骤(2)中，该菌株溶液的剂量为moi＝100。

14、进一步地，该液体培养基选自以下的一种或多种：bhi培养基、bhib培养基、r2a培养基、lb培养基、tsa培养基、na培养基、ma培养基、mb培养基、bhi-5％脱纤维羊血培养基、wilkins-chalgren培养基和mrs培养基。

15、进一步地，该菌株(例如益生菌)选自以下的一种或多种：冠克植物乳杆菌、另枝杆菌、类植物乳杆菌和粪肠球菌。

16、进一步地，该多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐的转染剂量为0.4μg/ml至2μg/ml。

17、进一步地，该多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐的转染剂量为0.4μg/ml至1μg/ml。

18、进一步地，该多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐的转染剂量为约0.5μg/ml。

19、进一步地，该转染试剂选自以下的一种或多种：polyfast转染试剂、转染试剂、pei转染试剂和x-tremegenetm转染试剂。

20、进一步地，该转染试剂为2000转染试剂。

21、进一步地，该转染试剂的剂量为1.5μl/μg～2.5μl/μg。

22、进一步地，该转染试剂的剂量为约2μl/μg。

23、进一步地，该干扰素刺激基因选自以下的一种或多种：isg15、isg54和isg56。

24、进一步地，该培养的时间为18小时至30小时。

25、进一步地，该培养的时间为约24小时。

26、进一步地，该刺激的时间为24小时至60小时。

27、进一步地，该刺激的时间为40小时至56小时。

28、进一步地，该刺激的时间为约48小时。

29、进一步地，该方法在孔板例如12孔细胞培养板中进行。

30、进一步地，该方法包括如下的[1]～[8]项中的任意一项或者多项：

31、[1]在步骤(1)中，以2.5×105～3.5×105个/孔的细胞数铺板，例如以约3.0×105个/孔的细胞数铺板；

32、[2]在步骤(1)之后，在步骤(2)之前，调整该液体培养基的麦氏浊度从4至2；

33、[3]在步骤(1)之后，在步骤(2)之前，该摇菌是在约37℃下200～250rpm的摇床中进行；

34、[4]在步骤(1)之后，在步骤(2)之前，该离心是9000～11000rpm 4～6min 20～30℃离心，例如该离心是约10000rpm约5min约25℃离心；

35、[5]在步骤(1)之后，在步骤(2)之前，该洗涤所使用的是无菌pbs和/或细胞培养基；

36、[6]在步骤(3)中，将多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐(poly(i:c))和转染试剂混匀、顺离、静置10-15min之后，再加入该上皮细胞中；

37、[7]在步骤(3)中，该刺激包括在将多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐(poly(i:c))和转染试剂加入所述上皮细胞中培养约6小时后，弃去细胞孔中的液体，加入该第二细胞培养液，继续培养约42小时；

38、[8]在步骤(4)中，该检测为荧光定量pcr检测。

39、根据本发明的另一个方面，提供了一种上述方法在细胞水平筛选具有固有免疫增强性能菌株的应用。

40、根据本发明的另一个方面，提供了一种细胞平台，该细胞平台包括如何使用上述方法的说明书。

41、本发明的有益效果：

42、本发明以sars-cov-2的靶细胞系a549-ace2作为细胞模型，以具有免疫增强作用的植物乳杆菌冠克为试验菌株，将益生菌冠克与多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐(poly(i:c))联合作用于肺癌上皮细胞，通过干扰素基因水平表达情况，筛选出增强固有免疫的益生菌。本发明的方法简便、实用且高效。

技术特征：

1.一种在细胞水平筛选具有固有免疫增强性能菌株的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基选自以下的一种或多种：dmem培养基、mem培养基和prmi1640培养基；

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上皮细胞为肺癌上皮细胞；

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之后，在步骤(2)之前，所述方法进一步包括所述菌株溶液的前处理步骤：将菌株从保菌管中取出并活化约24小时之后，刮取部分菌落于液体培养基中摇菌、离心、洗涤和悬浮，得到所述菌株溶液；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述液体培养基选自以下的一种或多种：bhi培养基、bhib培养基、r2a培养基、lb培养基、tsa培养基、na培养基、ma培养基、mb培养基、bhi-5％脱纤维羊血培养基、wilkins-chalgren培养基和mrs培养基。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐的转染剂量为0.4μg/ml至2μg/ml；

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干扰素刺激基因选自以下的一种或多种：isg15、isg54和isg56；

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下的[1]～[8]项中的任意一项或者多项：

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法在细胞水平筛选具有固有免疫增强性能菌株的应用。

10.一种细胞平台，其特征在于，所述细胞平台包括如何使用根据权利要求1至8中任一项所述的方法的说明书。

技术总结本发明公开了一种在细胞水平筛选具有固有免疫增强性能菌株的方法，该方法包括下列步骤：(1)使用细胞培养基对在体外可进行培养的人或动物上皮细胞进行培养至单层细胞；(2)将菌株溶液和第一细胞培养液加入该上皮细胞进行培养一段时间，弃去含菌的细胞培养液，洗涤，加入第二细胞培养液；(3)加入多聚肌苷‑多聚胞苷酸钠盐(poly(I:C))和转染试剂，使该多聚肌苷‑多聚胞苷酸钠盐转染进入该上皮细胞内进行刺激；以及(4)收取该上皮细胞，检测IFN‑β的基因和蛋白表达水平，和/或检测干扰素刺激基因的表达水平。本发明利用该方法，通过干扰素基因水平表达情况，筛选出增强固有免疫的菌株。该方法简便、实用且高效。技术研发人员：徐建国,罗雪莲,范前进,曹治杰,杨晶,任志鸿,刘丽云受保护的技术使用者：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所技术研发日：技术公布日：2024/6/18