一种低内毒素海蜇胶原蛋白溶液及其制备方法与流程

本发明涉及胶原蛋白提取，具体涉及一种低内毒素海蜇胶原蛋白溶液及其制备方法。

背景技术：

1、目前，胶原蛋白的抗衰、医美、美容、保健等功效已经得到研究证实。但是，传统陆生动物源的胶原蛋白存在疯牛病毒、猪瘟病毒等潜在生物风险。海蜇胶原蛋白具有原料来源丰富、免疫原性低、促伤口愈合能力强、无陆生动物病毒污染风险等突出优势。

2、然而，海蜇胶原蛋白由于前端原料本身携带各种微生物，或工艺控制等原因，导致后端提取的胶原蛋白产品中内毒素残留量较高，影响了胶原蛋白在下游产品的应用，例如胶原蛋白填充材料、胶原蛋白海绵以及胶原蛋白敷料等医疗器械类产品。

3、胶原蛋白产品中内毒素为细菌内毒素，细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖，由核心多糖、类脂a和o-特异侧链组成，其具有很高的热稳定性。虽然内毒素口服或外用毒性较小，但若在人体皮肤或组织受损的情况下接触，存在入血风险，可能导致机体发热、血管扩张等症状。因此，从应用安全性的角度考虑，需对胶原蛋白产品中内毒素的残留量进行控制，使其含量达到安全限量水平。

4、现有的内毒素的脱除技术主要针对注射剂型的化学药物和生物制品等。如针对小分子化学药物，常采用超滤法去除中药注射液中的细菌内毒素，其原理是通过超滤膜截留内毒素，超滤膜的截留分子量一般选择10kd或50kd。内毒素单体分子的分子量一般在10kda左右，而内毒素在水溶液中可以相互缔合，形成表观分子量更大的胶束结构，这些缔合物的分子量可达到数十至数百万da，然而，胶原蛋白分子量为100kd-300kd，若采用此规格超滤膜，存在胶原蛋白与内毒素一同被截留的问题，故并不适用。活性炭吸附是另外一种有效的内毒素脱除方法，但这种方法主要针对组分简单的小分子或注射水的内毒素去除，如果应用于胶原蛋白等生物大分子，存在胶原蛋白损失较大的问题，且后期需去除并严格控制活性炭颗粒残留。此外，申请号为202210102468.6的专利申请公开了一种采用阳离子交换技术制备低内毒素胶原蛋白的方法，但其针对的是重组胶原蛋白。公开号为cn113444761a的专利申请公布了一种低免疫原性鱼皮胶原蛋白及其制备方法，采用过氧化氢氧化结合辐照的方法灭活内毒素，但过氧化氢对胶原蛋白结构有较强氧化破坏作用，会导致胶原蛋白发生降解，并且最终产品中存在双氧水残留的风险，限制了胶原蛋白在下游医疗器械类产品中的应用。

5、为此，需要提供一种能够降低内毒素残留同时不影响胶原蛋白产品应用的制备工艺。

技术实现思路

1、(一)要解决的技术问题

2、为了解决现有技术中存在的海蜇胶原蛋白中残留内毒素，并且现有技术中脱除内毒素后会影响胶原蛋白的下游应用的问题，本发明提供一种低内毒素海蜇胶原蛋白溶液及其制备方法。

3、(二)技术方案

4、为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

5、第一方面，本发明提供一种低内毒素海蜇胶原蛋白溶液的制备方法，包括如下步骤：

6、s1：海蜇清洗后取伞部组织，切块后进行碱处理，再水洗至中性，得到海蜇样品；

7、s2：海蜇样品磨浆后，采用蛋白酶进行酶解，得到酶解物；

8、s3：对酶解物进行离心处理，然后对离心后的上清液进行微滤处理，得到滤液；

9、s4：向滤液中加入乙二胺四乙酸后进行超声处理以使内毒素解聚成内毒素单体，然后进行超滤浓缩处理，得到浓缩液；

10、s5：浓缩液稀释后至少重复进行一次步骤s4的操作，得到超滤浓缩液；

11、s6：向超滤浓缩液加入生理盐水，得到胶原蛋白溶液；

12、s7：将胶原蛋白溶液置于60co辐照场内进行辐照处理，辐照剂量为12-20kgy，得到低内毒素胶原蛋白溶液。

13、上述步骤s1中，碱处理能够有效消减海蜇原料中携带的微生物及内毒素，并且使胶原蛋白纤维束结构松散，易于后续的酶解提取。上述步骤s3中，通过离心处理进行固液分离，能够在上清液中获得胶原蛋白粗提取液，并且离心处理还能够去除部分菌体。

14、上述步骤s3中，微滤的孔径为0.22-0.45μm，微滤处理过程中使用的微滤膜可以是pp膜片、pvdf膜片、pes膜片、ca膜片、ptfe膜片、nylon膜片、中空纤维超滤膜片中的至少一种，优选为pes膜片或ca膜片。pes微滤膜具有高流速、高通量、低蛋白吸附、低溶出等特性。ca醋酸纤维素滤膜具有亲水性好、生物相容性佳、低蛋白吸附的特点，用于除菌时具有较好的过滤效果。

15、海蜇原料所含的内毒素中既含有亲脂的低极性类脂a，又含有亲水的极性寡糖链，单体分子量约为10-20kd，在料液中易聚集形成分子量为300kd-1000kd的复合体，导致其在后续超滤工序中容易和胶原蛋白一同被截留。因此，上述步骤s4中，通过加入edta(乙二胺四乙酸)螯合料液中的金属离子，促进料液中内毒素胶束解聚成分子量更小的脂多糖单体，便于后续超滤浓缩时小分子量的脂多糖单体可透过超滤膜。在此基础上，进一步通过施加超声处理，能够进一步促进内毒素复合体的解聚。对胶原蛋白粗提取液进行超滤处理能够将胶原蛋白中的内毒素、杂蛋白及盐分等透过超滤膜进行去除并实现浓缩

16、上述步骤s7中，辐照剂量对胶原蛋白中的内毒素含量影响尤为关键，如果辐照剂量小于12kgy，则会导致内毒素含量不达标，存在安全风险，影响胶原蛋白在下游产品，例如胶原蛋白填充材料、胶原蛋白海绵以及胶原蛋白敷料等医疗器械类产品中的应用。如果辐照剂量大于20kgy，则会导致胶原蛋白进一步降解，也会影响胶原蛋白在医疗器械类产品中的应用。

17、优选地，本发明使用生理盐水将胶原蛋白稀释成质量体积百分比为0.2-1.0％的胶原蛋白稀溶液，相较于胶原蛋白粉干粉，在接受相同强度剂量的60co辐照的情况下，胶原蛋白稀溶液能够取得更优的内毒素清除效果。另外，该胶原蛋白稀溶液中的内毒素含量对60co辐照表现出很好的敏感性和响应性。

18、如上所述的低内毒素海蜇胶原蛋白溶液的制备方法，优选地，步骤s1中，海蜇为沙海蜇和/或面海蜇。

19、如上所述的低内毒素海蜇胶原蛋白溶液的制备方法，优选地，步骤s1中，将新鲜海蜇用纯水清洗后取伞部组织，切成方块，方块的长、宽、高分别为2-5cm，向切块后的海蜇中加入浓度为0.4-0.6m的氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液的浓度优选为0.5m，在3-5℃下浸泡5-7h，进行碱处理，优选在4℃下浸泡6h，并且每隔2-2.5h更换一次氢氧化钠溶液；

20、本步骤中，海蜇与氢氧化钠溶液的料液比w:v为1:1-1:2，优选为1:1.5。其中，海蜇与氢氧化钠溶液的料液比指的是海蜇的质量与氢氧化钠溶液的体积之间的比值，w/v中的w单位为g，v的单位为ml。

21、如上所述的低内毒素海蜇胶原蛋白溶液的制备方法，优选地，步骤s2中，海蜇样品磨浆后得到浆料，向浆料中加入酸溶液调节ph，酸溶液的浓度优选为0.5m，然后添加酸性蛋白酶，在3-5℃、ph为2-3的环境下酶解提取20-28h，优选为在4℃、ph为2.5的环境下酶解提取24h，酶解处理后将体系的ph调至4.0-6.0，优选为5.0，得到酶解物；本步骤中使用的酸溶液可以是醋酸溶液、柠檬酸溶液、盐酸溶液和乳酸溶液中的至少一种；

22、本步骤中，磨浆后的浆料与酸溶液的质量体积比w:v为1:0.5-1:1.5，优选为1:1，酸性蛋白酶与浆料和酸溶液混合物的料液比w:v为0.1-1％，w/v中的w单位为g，v的单位为ml。

23、酸性蛋白酶优选为胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等在酸性条件具有高活性的蛋白酶。

24、如上所述的低内毒素海蜇胶原蛋白溶液的制备方法，优选地，步骤s3中，将酶解物于3-5℃的温度下离心处理12-18min，相对离心力为10000-12000g。本步骤中的酶解温度优选为4℃，离心处理时间优选为15min，相对离心力优选为11000g。其中，离心力的单位g代表重力加速度，约等于9.8m/s2。

25、如上所述的低内毒素海蜇胶原蛋白溶液的制备方法，优选地，步骤s4中，向滤液中加入乙二胺四乙酸，直到乙二胺四乙酸的终浓度为4-6mm，优选为5mm，然后将溶液体系在超声功率为200-400w、超声频率为15-25khz条件下超声处理15-25min，超声处理后用截留分子量为80-120kd的切向流超滤膜进行超滤浓缩处理，得到浓缩液。本步骤中，超声处理的功率优选为300w，超声频率优选为20khz，超声处理时间优选为20min。超声处理后优选用截留分子量为100kd的切向流超滤膜进行超滤浓缩处理。

26、如上所述的低内毒素海蜇胶原蛋白溶液的制备方法，优选地，步骤s5中，通过生理盐水将浓缩液稀释到超滤浓缩处理前的体积，然后再次向稀释后的浓缩液中加入乙二胺四乙酸，进行超声处理，接着进行超滤浓缩处理，然后再次通过生理盐水将浓缩液稀释到超滤浓缩处理前的体积，再次对稀释后的浓缩液进行超滤浓缩处理；本步骤中，浓缩液通过生理盐水稀释、继续加入乙二胺四乙酸、超声处理以及超滤浓缩处理为一次完整的重复流程，该流程在本步骤中至少进行一次之后得到超滤浓缩液。

27、如上所述的低内毒素海蜇胶原蛋白溶液的制备方法，优选地，步骤s6中，向超滤浓缩液加入生理盐水，得到胶原蛋白质量体积百分比为0.2-1.0％的胶原蛋白溶液。

28、如上所述的低内毒素海蜇胶原蛋白溶液的制备方法，优选地，步骤s7处理得到的低内毒素胶原蛋白溶液中，内毒素含量低于0.5eu/ml。

29、第二方面，本发明还提供通过上述制备方法制备得到的低内毒素海蜇胶原蛋白溶液。

30、(三)有益效果

31、本发明的低内毒素海蜇胶原蛋白溶液的制备方法通过碱处理、酶解处理以及离心处理对海蜇中的胶原蛋白进行粗提取，然后加入edta，结合超声处理对胶原蛋白与金属离子以及细胞外基质等进行进一步分离，接着通过至少两次超滤处理对胶原蛋白进行提纯和浓缩，然后将得到的胶原蛋白溶液置于60co辐照场内进行辐照处理，通过控制辐照剂量，得到内毒素含量低于0.5eu/ml的胶原蛋白溶液。

32、本发明解决了海蜇胶原蛋白中内毒素残留带来的热原反应问题，制备得到的低内毒素胶原蛋白溶液中内毒素含量低于安全限量水平，胶原蛋白的含量并未发生减少，胶原蛋白本身的结构也没有发生明显破坏，并且也没有引入其他风险残留，可以安全应用到胶原蛋白填充材料、胶原蛋白海绵以及胶原蛋白敷料等医疗器械类产品中。