一种利用线虫和人细胞联合验证多巴胺信号通路的方法

本发明涉及生物，尤其是涉及一种利用线虫和人细胞联合验证多巴胺信号通路的方法。

背景技术：

1、新污染物在环境中广泛赋存，在大气、灰尘、土壤、水体等多种环境介质中均有检出，并会进一步富集到生物体和人体样品中。许多新污染物能够通过神经递质异常释放和基因差异表达，引起生物体多巴胺相关神经毒性，导致神经退行性变，对人类健康造成潜在威胁。

2、多巴胺是一种帮助细胞传送脉冲的神经递质，是生物体运动和学习的关键因子，腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase，ac)作为多巴胺信号级联中的一个关键组件，充当了调控和抑制的焦点，可以通过调节离子通道、参与多巴胺释放等方式，直接或间接调控多巴胺信号传导通路。多巴胺关键基因如dop-3则通过腺苷酸环化酶调控，对gi/go偶联蛋白和多巴胺d2受体结合产生抑制作用，且gi/go偶联蛋白会通过三磷酸肌醇(inositoltriphosphate，ip3)增加细胞内钙离子(ca2+)浓度，因此，腺苷酸环化酶是多巴胺信号级联通路的重要部分。

3、秀丽隐杆线虫因其具有高度遗传保守的302个神经元、与人类基因60％-80％同源性等特点，是环境毒理学常用的模式生物，具有培养方便、筛查快速等特点。尽管目前利用秀丽隐杆线虫研究神经毒性机制的方法较为成熟，通常使用转录组测序、通路富集和基因转录验证等多学科交叉技术，但秀丽隐杆线虫所探究得到的毒性效应如何推导至人体健康风险仍有待研究。同时，尽管秀丽隐杆线虫与人体基因存在部分同源性，但基于模式生物的毒性分子机制仍需要在人体细胞进行同源性验证，新污染物诱导神经毒性的多巴胺信号通路相关潜在健康风险机制仍需进一步完善。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种利用秀丽隐杆线虫-人神经细胞联合模型验证多巴胺信号通路的方法。本方法在利用秀丽隐杆线虫模型初步快速筛查多巴胺神经信号通路的基础上，使用人神经母细胞瘤细胞sk-n-sh对通路进行分析，在明确信号通路准确性的同时，从多物种同源性角度验证分子机制的模式生物-人体细胞种间相似性，揭示化学品诱导健康风险和潜在疾病的作用机制。

2、本发明的技术方案是提供了一种利用线虫和人细胞联合验证多巴胺信号通路的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

3、步骤1、在20℃生化培养箱中培养秀丽隐杆线虫，在长至含卵成虫阶段，使用裂解液将卵裂解到培养基内，并将卵孵育至l1期用于后续实验；

4、步骤2、收集同步化秀丽隐杆线虫，从培养基中收集l1期秀丽隐杆线虫于培养液中，加入环境浓度的新污染物、大肠杆菌菌液，暴露10d；

5、步骤3、收集暴露后秀丽隐杆线虫，进行多巴胺样基因表达测定；

6、步骤4、利用多巴胺样基因突变体进行基因功能验证；

7、步骤5、人神经母细胞瘤细胞sk-n-sh复苏、传代及化学品暴露，测定与多巴胺信号通路相关细胞钙离子荧光强度；

8、步骤6、加入人神经母细胞瘤细胞sk-n-sh膜腺苷酸环化酶抑制剂(2’,5’-dideoxyadenosine，dda)，再次测定钙离子浓度，与未添加dda细胞的钙离子浓度作对比；

9、步骤7、人神经母细胞瘤细胞sk-n-sh多巴胺基因测定；

10、步骤8、绘制秀丽隐杆线虫-人神经细胞联合模型验证下的多巴胺信号通路图。

11、进一步地，步骤1中，裂解液包含0.2g naoh，5ml naclo，随后定容至20ml。

12、进一步地，步骤1中，裂解出的卵铺在ngm培养基中央，置于20℃生化培养箱中孵育16-18h得到处于l1期线虫。

13、进一步地，步骤2中，培养液包含7.2ml产卵抑制剂、120μl胆固醇，并用k+溶液定容至120ml；在1l蒸馏水中加入2.386g kcl，2.98g nacl，0.333cacl，0.36g mg2so4配置成k+溶液；线虫暴露于化学品的实验浓度要求涵盖其在环境介质中的检测浓度。

14、进一步地，步骤2中，挑取一株大肠杆菌单菌落于培养箱中过夜震荡16-18h，随后离心将上层清液弃掉，下层大肠杆菌沉淀用k+溶液重悬，制成大肠杆菌菌液。

15、进一步地，步骤3中，首先提取线虫总rna并进行纯度测定、cdna合成、设计多巴胺样基因引物，进行qrt-pcr反应，反应完成后分析基因表达量。

16、进一步地，步骤4中，对秀丽隐杆线虫中多巴胺相关转运和表达的关键基因进行针对性敲除或抑制，得到多巴胺样基因突变体。

17、进一步地，步骤4中，将多巴胺样基因突变体暴露在化学品中，进行多巴胺信号通路相关运动表型差异性测定，验证通路中关键基因功能。

18、进一步地，步骤5中，将装有冻存细胞的冻存管迅速放入36-38℃水浴锅中快速升温，直到冻存液融化，离心后用培养基重悬，用于细胞传代；将正常传代的细胞暴露在化学品中48h，利用fluo-4钙离子荧光探针检测胞内钙离子浓度，利用细胞成像仪测定荧光强度并计算钙离子浓度水平。

19、进一步地，步骤6中，配制适当浓度的dda，加入至细胞培养板中，与化学品同步暴露48h后在细胞成像仪中测定并统计细胞钙离子荧光强度变化。

20、与现有技术项相比，本发明具有以下优点：

21、第一、秀丽隐杆线虫具有易于培养、不易染菌、筛查快速等优点，细胞能够避免模式动物实验的个体及不同组别差异性，本发明通过两者结合，能够结合双方优势，精准评估化学品的毒性效应及分子机制；

22、第二、本发明利用人体神经细胞对秀丽隐杆线虫筛选的多巴胺传导信号通路进行同源性分析，进一步验证通路内多个基因相互作用机制，比传统单一的模式生物验证更具有准确性。

23、第三、将秀丽隐杆线虫和人体细胞相结合，利用两者基因同源性，在验证信号通路的多物种同源性的同时，能够快速实现新污染物健康风险机制的外推。

技术特征：

1.一种利用线虫和人细胞联合验证多巴胺信号通路的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的利用线虫和人细胞联合验证多巴胺信号通路的方法，其特征在于，步骤1中，裂解液包含0.2g naoh，5ml naclo，随后定容至20ml。

3.根据权利要求1所述的利用线虫和人细胞联合验证多巴胺信号通路的方法，其特征在于，步骤1中，裂解出的卵铺在ngm培养基中央，置于20℃生化培养箱中孵育16-18h得到处于l1期线虫。

4.根据权利要求1所述的利用线虫和人细胞联合验证多巴胺信号通路的方法，其特征在于，步骤2中，培养液包含7.2ml产卵抑制剂、120μl胆固醇，并用k+溶液定容至120ml；在1l蒸馏水中加入2.386g kcl，2.98g nacl，0.333cacl，0.36g mg2so4配置成k+溶液；线虫暴露于化学品的实验浓度要求涵盖其在环境介质中的检测浓度。

5.根据权利要求4所述的利用线虫和人细胞联合验证多巴胺信号通路的方法，其特征在于，步骤2中，挑取一株大肠杆菌单菌落于培养箱中过夜震荡16-18h，随后离心将上层清液弃掉，下层大肠杆菌沉淀用k+溶液重悬，制成大肠杆菌菌液。

6.根据权利要求1所述的利用线虫和人细胞联合验证多巴胺信号通路的方法，其特征在于，步骤3中，首先提取线虫总rna并进行纯度测定、cdna合成、设计多巴胺样基因引物，进行qrt-pcr反应，反应完成后分析基因表达量。

7.根据权利要求1所述的利用线虫和人细胞联合验证多巴胺信号通路的方法，其特征在于，步骤4中，对秀丽隐杆线虫中多巴胺相关转运和表达的关键基因进行针对性敲除或抑制，得到多巴胺样基因突变体。

8.根据权利要求1所述的利用线虫和人细胞联合验证多巴胺信号通路的方法，其特征在于，步骤4中，将多巴胺样基因突变体暴露在化学品中，进行多巴胺信号通路相关运动表型差异性测定，验证通路中关键基因功能。

9.根据权利要求1所述的利用线虫和人细胞联合验证多巴胺信号通路的方法，其特征在于，步骤5中，将装有冻存细胞的冻存管迅速放入36-38℃水浴锅中快速升温，直到冻存液融化，离心后用培养基重悬，用于细胞传代；将正常传代的细胞暴露在化学品中48h，利用fluo-4钙离子荧光探针检测胞内钙离子浓度，利用细胞成像仪测定荧光强度并计算钙离子浓度水平。

10.根据权利要求1所述的利用线虫和人细胞联合验证多巴胺信号通路的方法，其特征在于，步骤6中，配制适当浓度的dda，加入至细胞培养板中，与化学品同步暴露48h后在细胞成像仪中测定并统计细胞钙离子荧光强度变化。

技术总结本发明涉及生物技术领域，提供了一种利用线虫和人细胞联合验证多巴胺信号通路的方法，基于外源化学品尤其是新污染物环境浓度暴露，对秀丽隐杆线虫的多巴胺调控基因表达情况进行测定，并利用人神经母细胞瘤细胞SK‑N‑SH对信号通路涉及的离子转运及化学酶进行验证，综合利用生物标志物验证化学品对生物体多巴胺神经信号通路的改变。本发明在传统的单一物种基因表达测定方法的基础上，为化学品诱导多物种信号通路的准确性及同源性验证提供了新思路。该方法利用模式生物的快速筛查与人体细胞体外研究相结合，预测化学品诱导的潜在健康风险机制，适合推广使用。技术研发人员：李辉,潘若琳,王晨,王晓丽,史崇丽受保护的技术使用者：上海大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18