可缓解酒精性肝损伤的猪肝脏来源的寡肽、其药物制备方法及应用

本发明涉及一种生物医药的应用，具体地说是一种可缓解酒精性肝损伤的猪肝脏来源的寡肽、其药物制备方法及应用。

背景技术：

1、酒精性肝病（ald）是世界范围内最常见的慢性肝病。酒精性肝病包括一系列疾病，包括无症状的肝脂肪变性、纤维化、肝硬化和酒精相关性肝炎及其并发症（腹水、门脉高压相关性出血、肝性脑病等）。现有的酒精性肝病的治疗措施包括戒酒、药物治疗、精神疗法、药物治疗和肝移植等。而现有的药物治疗伴有腹泻、恶心、嗜睡、头痛、失眠等不良反应。深入研究 ald 的发病机制和制定相关治疗策略，开发新型相关治疗药物，已成为亟待解决的医学问题。研究表明，酒精性肝病的发病机制研究主要包括酒精代谢、氧化应激、脂肪变性、炎症、纤维化、肠道菌群的改变、细胞凋亡和坏死等方面。在肝病发生之前，酒精摄入就会导致肠道菌群组成的变化,这些改变随着疾病的进展而恶化，并可能与疾病进展有关。

2、生物活性肽是具有特定生物功能的氨基酸短链。这些生物活性化合物被消化并转化为更小的肽，在消化过程中很容易被肠道吸收。进入血流的肽可以到达人体部位，产生所需的效果。在不同的体外实验中，这些生物肽是抗糖尿病、降胆固醇、降压、抗癌、抗菌、促进酒精代谢或抗氧化的化合物。如扇贝酶解肽、人参低聚肽、豆粕肽、银杏叶肽、玉米肽和鱼皮低聚肽等均能够改善酒精导致的肝损伤。因此，生物活性肽可以调节身体的生理功能，保护人体免受氧化应激损伤，降低退行性疾病的风险，并可用于开发营养保健品或功能食品。

3、猪肝是蛋白质和生物活性肽的充足来源，富含维生素a、b12、c和d以及铁、锌和铜等其他矿物质, 肝多肽是从猪新鲜肝脏中提取的小分子多肽物质。前期研究表明，肝多肽能够刺激肝细胞 dna 合成，促进肝细胞再生，加速肝脏修复，稳定肝脏环境，防止肝细胞损伤乃至坏死，改善酒精诱导的肝损伤。其中，猪肝脏蛋白regucalcin为主要源的寡肽与缓解酒精性肝损伤关系紧密，在肝病保护中具有良好的应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供一种可缓解酒精性肝损伤的猪肝脏来源的寡肽、其制备方法及应用，以解决酒精性肝病治疗药物存在有较多不良反应的问题。

2、本发明的目的是这样实现的：一种可缓解酒精性肝损伤的猪肝脏来源的寡肽，所述寡肽的序列为：lys-ile-thr-gly-leu-gly-val-lys，称为：kitglgvk。

3、本发明的目的还可这样实现：一种kitglgvk的药物制备方法，包括以下步骤：

4、s1、利用串联easy-nanolc 1200的q exactive™质谱仪技术对猪肝脏的肝多肽中肽段进行分离和鉴定，结合质谱数据库信息注释，精准定性，得到肝多肽丰度最高的五种肽段的信息。

5、s2、将肝多肽丰度最高的五种肽段运用固相合成多肽法进行合成，获得具有缓解酒精性肝损伤活性的多肽。

6、s3、采用高效液相色谱仪（hplc）和质谱仪（ms）对所获得的多肽的目标化合物肽序、分子量和化学纯度进行质量分析，得到具有保护肝活性目标的寡肽kitglgvk。

7、进一步地，本发明步骤s1的具体方式为：

8、s1-1样品制备：将猪肝多肽样品用水溶解，对溶解物使用10kd超滤管进行超滤；使用waters sep-pak c18固相萃取小柱进行脱盐处理，然后冻干；用甲酸水对冻干粉进行复溶，离心后取上清，进行检测；

9、s1-2色谱分离：液相所用的a液为0.1%的甲酸水溶液，b液为0.1%的甲酸乙腈水溶液，其中，乙腈为80%；液相色谱柱（50μm150mm，acclaim pepmaptm rslc，thermoscientific technology inc.）以92%的a液进行平衡，进样量1μl，经色谱柱分离，相关液相梯度参数设置为：0-98min，b液线性梯度从8%到28%；98min-113min，b液线性梯度从28%到37%；113min-117min，b液线性梯度从37%到100%；117min-120min，b液维持在100%；

10、s1-3质谱鉴定：用毛细管经液相色谱分离后，用thermo qe hf质谱仪进行质谱分析，分析时长为120min；检测方式：正离子；多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集20个碎片图谱（ms2 scan）；扫描范围400-1800，一级分辨率60000，二级分辨率15000，碰撞能ce28ev；

11、s1-4数据分析：质谱测试原始文件（raw file）用软件proteome discoverer 2.5检索相应的数据库，最后得到多肽鉴定结果为kitglgvk、hvgdlgnvtagk、vaehpqlvsk、tvlvtgtik和apvssvalr，使用multipep软件筛选分值大于0.5的肽段为活性最好的肽段，kitglgvk为所需要的肽段。

12、进一步地，本发明步骤s2的具体方式为：

13、s2-1肽链都是从c端的氨基酸开始链接，向n端进行；

14、s2-2树脂活化：取树脂于洁净干燥的反应管中，加入适量dmf，活化30min；

15、s2-3氨基酸链接：称取计算得出量的c端首位氨基酸fmoc-leu-oh（被保护）及diea加入到反应管，加入过量dmf作为溶剂反应；

16、s2-4洗脱fmoc保护：脱fmoc，洗涤；耦合，洗涤；

17、s2-5检测：固相多肽合成中，主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率，检测方法称为kaiser方法；

18、s2-6检测成功后，重复s2-3到s2-5，继续链接c端第二个氨基酸；

19、s2-7当氨基酸全部链接完成后，分别加入dmf和diea，然后加叠氮乙酸反应2h；再用三氟乙酸切割液切割2.5h-5h，反应液抽滤，得到多肽的三氟乙酸溶液；然后用过量乙醚沉淀，离心，所得样品用乙醚洗脱，离心，得到粗肽样品；对粗肽样品进行过hplc纯化，经质谱分析检测，再用液氮速冷冻干；

20、s2-8使用高效液相色谱仪和质谱仪对合成的kitglgvk进行分析，检测合成的肽段序列为kitglgvk，分子量为815.01da，化学纯度为96.79%，确定合成物质为kitglgvk。

21、本发明的目的还可这样实现：kitglgvk在制备防治酒精性肝病的药物中的应用，包括以下步骤：

22、s1、构建sd大鼠酒精诱导的ald模型；

23、s2、用kitglgvk进行药物治疗；

24、s3、药效学评价；

25、s4、对大鼠粪便肠道菌群检测；

26、s5、对实验结果与数据进行分析。

27、本发明提供了一种固相法制备猪肝脏来源寡肽的合成肽kitglgvk，以树脂为起始原料，依次连接具有羧基保护的的氨基酸（fmoc-leu-oh），制备保护的太段片段，期间脱去fmoc基团，用弱酸切断得到保护的肽段片段，之后继续链接c端第二个氨基酸；以切割液切除保护基团及树脂,得到合成肽kitglgvk粗肽；经过hplc系统纯化、去除盐后得到kitglgvk（分子量为815.01da，化学纯度为96.79%）。本发明表明kitglgvk能够改善酒精诱导的肝脏损伤，肠道屏障损伤和肠道菌群紊乱，kitglgvk可应用于治疗酒精性肝病。本发明的方法具有生产周期短、原辅料来源安全方便、生产成本低、收率高等特点。

28、本发明所涉及的寡肽kitglgvk同时兼具改善酒精代谢、肝脏炎症、肝脏脂质积累和调节肠道菌群的作用，具有多药物靶点、高特异性和低毒性水平等特点，可发挥出保护肝脏的积极作用，有望为开发无毒副作用的缓解酒精性肝损伤新功能食品提供新的有效成分，因此，猪肝脏蛋白源的kitglgvk在治疗缓解酒精性肝病方面具有潜在的医学价值，并具有广泛的应用前景。