一种水稻白叶枯病菌主效毒力因子的鉴定方法

本发明属于农业领域，尤其是涉及一种水稻白叶枯病菌主效毒力因子的鉴定方法。背景技术：：：1、水稻白叶枯病是由稻黄单胞菌稻致病变种(xanthomonas oryzae pv.oryzae，xoo)引起的。作为水稻上最重要的细菌性病害之一，该病在我国各稻区均有发生，能造成水稻减产20％-30％，严重时可达50％-60％，甚至是绝收。培育和布局抗性品种是防治白叶枯病最经济有效的手段。目前，国内外已报道了近50个抗白叶枯基因，但由于病原菌的进化，这些抗病基因逐渐被克服。而目前已知的感病基因非常有限，仅有3个，利用这些感病基因及时、有效地对白叶枯病菌毒力因子进行监测，对选育和布局白叶枯病抗性水稻、减少产量损失至关重要。2、xoo通过iii型分泌系统向水稻细胞内分泌转录因子类效应蛋白(transcriptionactivator like effector，简称tale)，结合在水稻感病基因(susceptible gene,简称s基因)启动子区的ebe(effector binding element)序列上，激活s基因的表达，使水稻感病。并不是所有的tale都能使水稻感病，目前已鉴定到的能结合ossweet11a ebe序列的有pthxo1/avrxa27a；能结合到ossweet13 ebe序列的有pthxo2/pthxo2.1/tal5ln18/tal7pxo61/tal7k74；能结合到ossweet14 ebe序列的有pthxo3/avrxa7/talc/talf。这些主效毒性tale，结合在感病基因的ebe序列上后，通过激活这些感病基因的表达，向水稻细胞外转运糖类物质，为细菌提供营养从而促进病害的发生、发展。因此突变这3个感病基因的ebe序列，可以使主效毒力因子无法与启动子结合，从而使水稻呈现出抗病性。因此，用xoo菌株接种单个、两个和三个感病基因ebe突变的水稻株系，既可以鉴定只含有一个主效毒力因子的菌株，也可以鉴定出含有两个或两个以上主效毒力因子的菌株。3、crispr/cas9(成簇、规律间隔短回文重复序列及相关蛋白)系统是一种高效、精准和经济的基因编辑技术，在人类医学、农业和生物燃料等方面都有应用。曾有人用白叶枯病抗性基因构建白叶枯病菌的鉴别品种，但随着研究的深入发展，不断有新的抗病基因被鉴定，难以形成完善系统的鉴别品种株系。而水稻白叶枯病的感病基因数量很有限，目前已在田间发现可以被xoo识别并激活的仅有3个，利用crispr/cas9技术可以精准快速地对感病基因的ebe进行编辑，获得系统的水稻鉴别品种株系。且定点对启动子区的ebe序列进行编辑，可以最大限度地减少对这些基因本身生理功能的影响。4、中国专利cn113201548a公开了水稻ostfiiaγ1基因启动子中的ebe位点及应用。该方案中公开白叶枯病感病基因ostfiiaγ1启动子中ebe位点被编辑从而赋予水稻对白叶枯病的广谱抗性，与含有tale蛋白编码基因的白叶枯病菌直接关联。白叶枯病感病基因ostfiiaγ1启动子中ebe位点被编辑，在纯合状态下才能实现水稻由感病性转变为抗病性。基因编辑水稻白叶枯病感病基因ostfiiaγ1启动子中的ebe位点，也缩短了水稻育种周期。同时基因编辑白叶枯病感病基因ostfiiaγ1启动子中的ebe位点的水稻植株，没有明显的农艺性状变化，即ebe位点的编辑，不会造成明显的水稻农艺性状改变。该方案是利用ebe位点被编辑从而赋予水稻对白叶枯病的广谱抗性。5、中国专利cn116789786a公开了一种水稻xa48(t)蛋白及其编码基因的应用，所述应用包括增强水稻对白叶枯病的抗性、增强水稻对稻瘟病的抗性或水稻抗病育种，该方案采用rnai干涉技术、基因敲除技术和基因过表达技术处理目标植株，选用以hny为背景的xa48(t)基因，敲除植株t3代、rnai干涉植株t3代和以日本晴为背景的xa48(t)基因过表达植株t3代为研究对象，对这些植株进行水稻白叶枯病接种调查，结果表明敲除和干涉基因xa48(t)后水稻植株对白叶枯病抗性明显下降。6、目前尚未报道有人对水稻白叶枯病的三个感病基因ossweet11a、ossweet13和ossweet14的启动子ebe序列进行单、双和三位点的突变，以鉴定xoo的主效毒力因子，利于抗性品种布局。技术实现思路1、本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种水稻白叶枯病菌主效毒力因子的鉴定方法。2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：3、本发明首先提供感病基因启动子被编辑的水稻材料，感病基因启动子被编辑的水稻材料分别为ms1k、ms3k、ms4k、ms13k、ms14k、ms34k和ms134k，感病基因启动子被编辑的水稻材料是指在野生型水稻kitaake基础上编辑的新材料，4、其中，ms1k中的感病基因ossweet11a启动子ebe序列被编辑为seq idno.1所示的序列；ms3k中的感病基因ossweet13启动子ebe序列被编辑为seq id no.2所示的序列；ms4k中的感病基因ossweet14启动子ebe序列被编辑为seq id no.3所示的序列；ms13k中的ossweet11a和ossweet13启动子ebe序列分别被编辑为seq id no.4所示的序列和seq idno.5所示的序列；ms14k中的ossweet11a和ossweet14启动子ebe序列分别被编辑为seq idno.6所示的序列和seq id no.7所示的序列；ms34k中的ossweet13和ossweet14启动子ebe序列分别被编辑为seq id no.2所示的序列和seq id no.8所示的序列；ms134k中的ossweet11a、ossweet13和ossweet14的启动子ebe序列分别被编辑为seq id no.6所示的序列、seq id no.9所示的序列和seq id no.7所示的序列。5、本发明提供一种水稻白叶枯病菌主效毒力因子的鉴定方法，包括以下步骤：6、基于野生型水稻kitaake，构建感病基因启动子被编辑的水稻材料，野生型水稻kitaake和感病基因启动子被编辑的水稻材料构成一套水稻近等基因系材料；7、用白叶枯病菌剪叶接种这套水稻近等基因系材料后，根据水稻的抗感病反应型，来鉴定白叶枯病菌所含主效毒力因子类型和数量；8、其中，感病基因启动子被编辑的水稻材料分别为ms1k、ms3k、ms4k、ms13k、ms14k、ms34k和ms134k，感病基因启动子被编辑的水稻材料是指在野生型水稻kitaake基础上编辑的新材料。9、其中，ms1k中的感病基因ossweet11a启动子ebe序列被编辑为seq idno.1所示的序列；ms3k中的感病基因ossweet13启动子ebe序列被编辑为seq id no.2所示的序列；ms4k中的感病基因ossweet14启动子ebe序列被编辑为seq id no.3所示的序列；ms13k中的ossweet11a和ossweet13启动子ebe序列分别被编辑为seq id no.4所示的序列和seq idno.5所示的序列；ms14k中的ossweet11a和ossweet14启动子ebe序列分别被编辑为seq idno.6所示的序列和seq id no.7所示的序列；ms34k中的ossweet13和ossweet14启动子ebe序列分别被编辑为seq id no.2所示的序列和seq id no.8所示的序列；ms134k中的ossweet11a、ossweet13和ossweet14的启动子ebe序列分别被编辑为seq id no.6所示的序列、seq id no.9所示的序列和seq id no.7所示的序列。10、其中，感病基因启动子被编辑的水稻材料包括了对三个白叶枯病感病基因ossweet11a、ossweet13和ossweet14启动子中的ebe分别进行单一、两个和三个同时的编辑，形成了一套含有1个野生型kitaake(粳稻品种)、3个单基因编辑株、3个双基因编辑株和1个三基因编辑株的水稻近等基因系材料。11、其中ms1k在ossweet11a基因启动子缺失10个碱基；ms3k在ossweet13基因启动子缺失5个碱基；ms4k在ossweet14基因启动子缺失5个碱基；ms13k在ossweet11a基因启动子缺失4个碱基，在ossweet13基因启动子缺失2个碱基；ms14k在ossweet11a基因启动子缺失5个碱基，在ossweet14基因启动子缺失5个碱基；ms34k在ossweet13基因启动子缺失5个碱基，在ossweet14基因启动子缺失7个碱基；ms134k在ossweet11a基因启动子缺失5个碱基，在ossweet13基因启动子缺失5个碱基，在ossweet14基因启动子缺失5个碱基。12、在本发明的一个实施方式中，感病基因启动子被编辑的水稻材料的获得方法，包括以下构建步骤：13、(1)sgrna靶位点的选择：14、根据crispr/cas9技术靶点设计原则，分别在ossweet11、ossweet13和ossweet14基因启动子区域选取靶位点序列sw11、sw13和sw14，选择的靶点位于ossweet11、ossweet13和ossweet14基因启动子反义链上含有ngg序列特征的序列，即靶点序列sw11、sw13和sw14，其中，sw11位于ossweet11基因转录起始位点上游第239位至第220位，其序列如seq idno.10所示，sw13位于ossweet13基因转录起始位点上游第226位至第207位，其序列如seqid no.11所示，sw14位于ossweet14基因转录起始位点上游第250位至第231位，其序列如seq id no.12所示；15、(2)构建含有sw11、sw13和sw14序列的单一、两个和三个的表达载体cas9-grna4-sw11、cas9-grna4-sw13、cas9-grna4-sw14、cas9-grna4-sw1113、cas9-grna4-sw1114、cas9-grna4-sw1314和cas9-grna5-sw111413：16、根据选定的grna靶点序列，合成引物sw11-grna-f/sw11-grna-r、sw13-grna-f/sw13-grna-r和sw14-grna-f/sw14-grna-r，将这些引物通过两两退火方法合成双链dnagrnasw11、grna-sw13和grna-sw14；将grna-sw11和grna-sw13分别经btgzi酶切、grna-sw14经bsai酶切连接后插入pentr：grna4载体的u6p启动子下游，获得三个单突变的中间载体pgrna4-sw11,grna4-sw13和grna4-sw14；将grna-sw13和grna-sw14经bsai酶切连接后分别插入pgrna4-sw11和grna4-sw13、将grna-sw11经btgzi酶切连接后插入pgrna4-sw14，或者三个双基因突变体pgrna4-sw1113、grna4-sw1314和grna4-sw1114；同时，将grna-sw13经btgzi酶切后连接至pentr：grna5载体的u6p启动子下游，获得中间载体pgrna5-sw13；从pgrna4-sw1114载体上经hindiii酶切得到含有grna-sw11和grna-sw14的dna片段，将其连接至pgrna5-sw13载体的hindiii酶切位点，获得三基因突变中间载体pgrna5-sw111413；再通过gateway方法将7个中间载体片段克隆到pby02-oscas9-ccdb载体上，获得重组载体cas9-grna4-sw11、cas9-grna4-sw13、cas9-grna4-sw14、cas9-grna4-sw1113、cas9-grna4-sw1114、cas9-grna4-sw1314和cas9-grna5-sw111413；17、(3)表达载体cas9-grna4-sw11、cas9-grna4-sw13、cas9-grna4-sw14、cas9-grna4-sw1113、cas9-grna4-sw1114、cas9-grna4-sw1314和cas9-grna5-sw111413转化进入根癌农杆菌eha105：18、将(2)中的重组载体cas9-grna4-sw11、cas9-grna4-sw13、cas9-grna4-sw14、cas9-grna4-sw1113、cas9-grna4-sw1114、cas9-grna4-sw1314和cas9-grna5-sw111413通过热激方法转化进入农杆菌eha105菌株中，获得含有重组表达载体的重组农杆菌，命名为eha105/cas9-grna4-sw11、eha105/cas9-grna4-sw13、eha105/cas9-grna4-sw14、eha105/cas9-grna4-sw1113、eha105/cas9-grna4-sw1114、eha105/cas9-grna4-sw1314和eha105/cas9-grna5-sw111413；19、(4)农杆菌介导的水稻转化：20、利用重组根癌农杆菌eha105/cas9-grna4-sw11、eha105/cas9-grna4-sw13、eha105/cas9-grna4-sw14、eha105/cas9-grna4-sw1113、eha105/cas9-grna4-sw1114、eha105/cas9-grna4-sw1314和eha105/cas9-grna5-sw111413侵染水稻成熟胚诱导的愈伤组织，在含潮霉素抗生素培养基上成功再生及生根的植株为靶位点突变的水稻。21、所述sw11-grna-f序列如seq id no.13所示，sw11-grna-r序列如seq id no.14所示，sw13-grna-f序列如seq id no.15所示，sw13-grna-r序列如seq id no.16所示，sw14-grna-f序列如seq id no.17所示，sw14-grna-r序列如seq id no.18所示。22、以上方案中，pentr：grna4，pentr：grna5或pby02-oscas9-ccdb，pentr：grna4，pentr：grna5或pby02-oscas9-ccdb来源于中国农业科学院植物保护研究所周焕斌实验室，已在文献《huanbin zhou,bo liu,donald p.weeks,martin h.spalding and bingyang.2014,large chromosomal deletions and heritable small genetic changesinduced by crispr/cas9in rice.nucleic acids research,42(17):10934-10914》中公开。23、在本发明的一个实施方式中，用未知基因组的xoo同时剪叶接种这套水稻近等基因系材料后，根据接种水稻的抗、感病表型，推测其中含有的主效毒力因子；设定时间后调查病斑长度，最后取多个叶片的平均值，做t-test差异分析(p<0.05)，平均病斑长度≤3cm为抗病表型，平均病斑长度＞3cm为感病表型。24、在本发明的一个实施方式中，推测xoo的主效毒力因子方法如下：25、白叶枯病菌接种kitaake和7个突变体水稻材料后，26、(1)在ms1k、ms13k、ms14k和ms134k上抗病，在kitaake、ms3k、ms4k和ms34k上感病，指示白叶枯病菌的主效毒力因子为pthxo1/avrxa27a；27、(2)在ms3k、ms13k、、ms34k和ms134k上抗病，在kitaake、ms1k、ms4k和ms14k上感病，指示白叶枯病菌的主效毒力因子为tal5ln18/tal7pxo61；28、(3)在ms4k、ms14k、ms34k和ms134k上抗病，在kitaake、ms1k、ms3k和ms13k上感病，指示白叶枯病菌的主效毒力因子为pthxo3/avrxa7；29、(4)在ms34k和ms134k上抗病，在kitaake、ms1k、ms3k、ms4k、ms13k和ms14k上感病，指示白叶枯病菌的主效毒力因子为pthxo1/avrxa27a和tal5ln18/tal7pxo61；30、(5)在ms14k和ms134k上抗病，在kitaake、ms1k、ms3k、ms4k、ms13k和ms34k上感病，指示白叶枯病菌的主效毒力因子为pthxo1/avrxa27a和pthxo3/avrxa7；31、(6)在ms34k和ms134k上抗病，在kitaake、ms1k、ms3k、ms4k、ms13k和ms14k上感病，指示白叶枯病菌的主效毒力因子为tal5ln18/tal7pxo61和pthxo3/avrxa7；32、(7)仅在ms134k上抗病，在kitaake、ms1k、ms3k、ms4k、ms13k、ms14k和ms34k上感病，指示白叶枯病菌的主效毒力因子为pthxo1/avrxa27a、tal5ln18/tal7pxo61和pthxo3/avrxa7；33、(8)在kitaake和7个突变体水稻材料上均为抗病表型，指示白叶枯病菌的主效毒力因子为pthxo2/pthxo2.1/tal5k74；34、(9)在kitaake和7个突变体水稻材料上均为感病指示白叶枯病菌中存在未知的主效毒力因子。35、与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：36、本发明涉及的一套水稻白叶枯病感病基因编辑水稻材料，因为丧失了不同主效毒力因子的结合位点，可以根据剪叶接种xoo后的表型推测xoo中是否含有某种主效毒力因子。在实际应用中可通过对某一水稻种植区内收集的xoo进行鉴定，推测他们含有的主效毒力因子，以便指导区域内布局相应的抗性水稻品种，避免白叶枯病的爆发成灾。当前第1页12当前第1页12