一种新型酮糖3-差向异构酶及其在生产D-阿洛酮糖中的应用

本发明涉及基因工程和酶工程，特别是涉及一种新型酮糖3-差向异构酶及其在生产d-阿洛酮糖中的应用。

背景技术：

1、d-阿洛酮糖是一种天然的稀少糖，在自然界中含量极少所以极难直接获取。d-阿洛酮糖的甜度是蔗糖的70％，而热量仅为蔗糖的10％。d-阿洛酮糖具有降血糖、降血脂、抗氧化、预防动脉粥样硬化、清除活性自由基等特殊功能，可用于制备特医食品、保健品以及合成药物。作为一种特性出众的功能糖，d-阿洛酮糖具有巨大的商业价值和广阔的市场前景。

2、目前，利用酮糖3-差向异构酶催化d-果糖异构化是工业生产d-阿洛酮糖的主流方法。酮糖3-差向异构酶催化d-果糖生成d-阿洛酮糖是一个可逆反应，生产过程比较温和、简单、易控，只需一种酶、一步反应便可从d-果糖转化获得d-阿洛酮糖。目前已被功能鉴定的酮糖3-差向异构酶仅有40多个，主要来源于微生物，如pseudomonas sp.st-24、agrobacterium tumefaciens、rhodobactersphaeroides、clostridium cellulolyticum等。然而，这些酮糖3-差向异构酶普遍存在反应平衡转化率低(转化率最高仅为33％)、偏好碱性反应条件(引起糖的褐变、碱性异构化副反应)、热稳定性较差(易受热失活)等问题。更高转化率、中性偏酸性的，以及更好热稳定性的酮糖3-差向异构酶能够提升d-阿洛酮糖产量，提高原料利用率、减轻后处理产物分离负担和全面降低生产成本，是d-阿洛酮糖工业生产迫切需要的。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种新型酮糖3-差向异构酶及其在生产d-阿洛酮糖中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的mdae酶具有高转化率、中性偏弱碱性的最适ph，以及良好的稳定性，适合应用于高产d-阿洛酮糖，为d-阿洛酮糖的工业化生产奠定重要基础。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种新型酮糖3-差向异构酶mdae的基因，其核苷酸序列如seq idno.1所示。

4、本发明还提供一种新型酮糖3-差向异构酶mdae，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

5、本发明还提供一种重组载体，包含上述基因。

6、本发明还提供一种重组菌，包含上述重组载体。

7、本发明还提供一种上述基因或上述新型酮糖3-差向异构酶mdae或上述重组载体或上述重组菌在生产d-阿洛酮糖中的应用。

8、进一步地，将所述新型酮糖3-差向异构酶mdae或所述重组菌与包含d-果糖的溶液混合反应，收获d-阿洛酮糖。

9、进一步地，所述混合反应的条件为40～95℃，ph 5.5～11。

10、进一步地，所述新型酮糖3-差向异构酶mdae以纯化酶、粗酶、固定化酶或表达含mdae酶的细胞、冻干细胞、固定化细胞的形式与包含d-果糖的溶液混合反应。

11、进一步地，所述重组菌选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、和酿酒酵母中的至少一种。

12、本发明公开了以下技术效果：

13、本发明提供了一种新型高转化率的酮糖3-差向异构酶mdae，其催化d-果糖转化为d-阿洛酮糖的转化率为34.1％，是目前为止最高转化率的酶。并且经实验证实，该酶在ph7.0-8.6范围内显示出90％以上的相对活性，在75℃孵育4h后有86％的活性，在ph 11.0孵育12小时后仍然保留50％的活性。结果表明mdae酶在中性、酸性、弱碱性条件下和较高温度下均有较高的酶活，该酶具有高转化率和良好稳定性，适合应用于高产d-阿洛酮糖，为d-阿洛酮糖的工业化生产奠定重要基础。

技术特征：

1.一种新型酮糖3-差向异构酶mdae的基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.一种新型酮糖3-差向异构酶mdae，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述基因。

4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求3所述重组载体。

5.一种如权利要求1所述基因或权利要求2所述新型酮糖3-差向异构酶mdae或权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组菌在生产d-阿洛酮糖中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述新型酮糖3-差向异构酶mdae或所述重组菌与包含d-果糖的溶液混合反应，收获d-阿洛酮糖。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述混合反应的条件为40～95℃，ph5.5～11。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述新型酮糖3-差向异构酶mdae以纯化酶、粗酶、固定化酶或表达含mdae酶的细胞、冻干细胞、固定化细胞的形式与包含d-果糖的溶液混合反应。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组菌选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母中的至少一种。

技术总结本发明公开了一种新型酮糖3‑差向异构酶及其在生产D‑阿洛酮糖中的应用，属于基因工程和酶工程技术领域，该酶的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明经实验证实，MDAE酶催化D‑果糖转化为D‑阿洛酮糖的转化率为34.1％，是目前为止最高转化率的酶。该酶在pH 7.0‑8.6范围内显示出90％以上的相对活性，在75℃孵育4h后还能保留86％的活性。结果表明MDAE酶在中性、酸性、碱性条件下和较高温度下均有较高的酶活，该酶具有高转化率和良好的稳定性，适合应用于高产D‑阿洛酮糖，为D‑阿洛酮糖的工业化生产奠定重要基础。技术研发人员：王子龙,王宏萌,庞浩,汤宏赤,杜丽琴,吴怡然,石馨梅,乔峰,郭媛,林丽华,刘艺受保护的技术使用者：广西科学院技术研发日：技术公布日：2024/6/18