热稳定性增强的BstDNA聚合酶突变体及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物，尤其是涉及热稳定性增强的bst dna聚合酶突变体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、来自嗜热脂肪芽孢杆菌的dna聚合酶i大片段由于其强大的链置换能力，在各种等温扩增反应中具有独特的用途，尤其是环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，lamp)中的首选聚合酶。lamp是一种功能强大且广泛使用的诊断方法，包括用于sars-cov-2检测，在灵敏度和速度上可以与pcr相媲美。由于其反应过程不需要热循环和相关的仪器，只需在恒温条件下进行，更适用于临床和检测现场的使用。随着lamp技术的推广与使用，对bst dna聚合酶的要求便也随之提升。而已有的bst dna聚合酶仍存在热稳定性较差、产物得率低等问题。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出bst dna聚合酶突变体，相比于野生型bst dna聚合酶，其具有更高的热稳定性，且lamp反应产物得率更高。

2、本发明还提供一种重组蛋白。

3、本发明还提供与上述bst dna聚合酶突变体或重组蛋白相关的生物材料。

4、本发明还提供一种酶制剂。

5、本发明还提供上述bst dna聚合酶突变体或重组蛋白的制备方法。

6、本发明还提供一种进行lamp反应的方法。

7、本发明还提供上述bst dna聚合酶突变体、重组蛋白、生物材料或酶制剂相关的应用。

8、本发明还提供一种试剂盒。

9、根据本发明的第一方面实施例的一种bst dna聚合酶突变体，在野生型bst dna聚合酶大片段的氨基酸序列上进行氨基酸突变，所述氨基酸突变包含h31i、c91k、s258d和t307p；所述野生型bst dna聚合酶大片段的氨基酸序列如seq id no:1所示。

10、根据本发明实施例的bst dna聚合酶突变体，至少具有如下有益效果：

11、相比野生型bst dna聚合酶，实施例的bst dna聚合酶突变体具有灵敏度高、热稳定性高、产物得率高等优点，在等温扩增、核酸检测方面中具有很好的应用前景。其经37℃热处理10天和75℃热处理1h后，仍保留有极高的酶活力，远优于野生型bst dna聚合酶。

12、根据本发明的一些实施例，所述bst dna聚合酶突变体的氨基酸序列如seq idno:3第12至590位所示。

13、根据本发明的第二方面实施例的一种重组蛋白，包含标签以及上述bst dna聚合酶突变体。

14、根据本发明的一些实施例，所述标签连接在所述bst dna聚合酶突变体的中间和/或n端或/和c端。

15、根据本发明的一些实施例，所述标签包括利于bst dna聚合酶突变体的溶解、纯化和检测的标签中的至少一种。可以理解的是，本发明的bst dna聚合酶突变体可以包含一个或多个标签；多个标签可以包含多个相同标签的组合，也可以为多个不同标签的组合。例如：利于bst dna聚合酶突变体溶解的标签包括但不限于nus标签或麦芽糖结合蛋白标签；利于bst dna聚合酶突变体纯化的标签包括但不限于strep标签、his标签、gst标签、pelb信号标签或ompa信号标签；利于bst dna聚合酶突变体检测的标签包括但不限于辣根过氧化物酶(hrp)标签、β-半乳糖苷酶标签、萤光素酶标签、绿色荧光蛋白(gfp)标签、hcred标签、dsred标签或青色荧光蛋白(cfp)标签。所述标签具体可以为his标签。

16、根据本发明的一些实施例，所述bst dna聚合酶突变体的氨基酸序列如seq idno:3所示。

17、根据本发明的第三方面实施例的与本发明第一方面实施例中所述的bst dna聚合酶突变体或本发明第二方面实施例中所述的重组蛋白相关的生物材料，所述生物材料为b1)至b4)中的任一种：

18、b1)、编码本发明第一方面实施例中所述的bst dna聚合酶突变体或本发明第二方面实施例中所述的重组蛋白的核酸分子；

19、b2)、含有b1)所述核酸分子的表达盒；

20、b3)、含有b1)所述核酸分子或b2)所述表达盒的重组载体；

21、b4)、含有b1)所述核酸分子、b2)所述表达盒或b3)所述重组载体的重组生物细胞。

22、根据本发明的一些实施例，所述核酸分子具有b11)至b14)中任一种：

23、b11)、如seq id no:4第34至1773位所示的核苷酸序列的dna分子；

24、b12)、如seq id no:4所示的核苷酸序列的dna分子；

25、b13)、与b11)或b12)所示的核苷酸序列具有80％、85％或90％以上的同源性，且编码所述bst dna聚合酶突变体的dna分子；

26、b14)、在严格条件下与b11)至b13)任一项限定的核苷酸序列杂交，且编码所述bstdna聚合酶突变体的dna分子。

27、根据本发明的一些实施例，所述严格条件可以为在2×ssc，0.1％ sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min；或在0.5×ssc，0.1％ sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

28、根据本发明的一些实施例，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述bst dna聚合酶突变体的dna。该dna不但可包括启动所述bst dna聚合酶突变体编码基因转录的启动子，还可包括终止所述bst dna聚合酶突变体编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

29、根据本发明的一些实施例，载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。例如：可以为pet-28a载体。

30、根据本发明的一些实施例，所述重组载体可以为在所述载体的多克隆位点插入编码所述bst dna聚合酶突变体的dna分子得到的重组载体。

31、根据本发明的一些实施例，生物细胞包括原核细胞和真核细胞。所述原核细胞包括细菌或藻。所述真核细胞包括真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。其中，所述细菌可以为大肠杆菌，如e.coli dh5α或e.coli bl21。所述重组生物不包含生殖材料。

32、根据本发明的一些实施例，所述重组生物细胞为向生物细胞中导入b1)所述核酸分子、b2)所述表达盒或b3)所述重组载体，得到的重组生物细胞。具体可以为向e.coli dh5α或e.coli bl21中导入重组载体得到的重组大肠杆菌。

33、根据本发明的第四方面实施例的一种酶制剂，包括本发明第一方面实施例中所述的bst dna聚合酶突变体或本发明第二方面实施例中所述的重组蛋白。

34、根据本发明的一些实施例，所述酶制剂还包括反应预混液。

35、根据本发明的一些实施例，所述反应预混液包括tris-hcl、mg2+、nh4+、dtt、dntps、bsa中的至少一种。

36、根据本发明的一些实施例，所述nh4+的来源为铵盐。所述铵盐包括有机铵盐(包括但不限于乙酸铵)、无机铵盐(包括但不限于(nh4)2so4、nh4cl或其组合)中的至少一种。

37、根据本发明的一些实施例，所述mg2+的来源包括氯化镁、乙酸镁、硫酸镁中的至少一种。

38、根据本发明的一些实施例，所述k+的来源包括氯化钾、乙酸钾、硫酸钾中的至少一种。

39、根据本发明的一些实施例，所述反应预混液包括10～50mmol/l tris-hcl、5～10mmol/lmg2+、8～12mmol/l nh4+、10～20mmol/l k+、1.0～2.0mmol/l dntps。例如：所述反应预混液可以包括20mmol/l tris-hc1、8mmol/l mg2+、10mmol/l nh4+、10mmol/l k+、1.4mmol/ldntps。

40、根据本发明的一些实施例，所述反应预混液的ph为8.5～9.2(例如：可以为8.8)。

41、可以理解的是，所述反应预混液以不影响所述bst dna聚合酶突变体或重组蛋白的活性为宜。

42、根据本发明的第五方面实施例的本发明第一方面实施例中所述的bst dna聚合酶突变体的制备方法，包括：

43、将本发明第一方面实施例中所述的bst dna聚合酶突变体或本发明第二方面实施例中所述的重组蛋白的编码基因导入生物细胞中，使所述编码基因得到表达，得到所述bstdna聚合酶突变体。

44、根据本发明的一些实施例，所述生物细胞包括原核细胞和真核细胞。

45、根据本发明的一些实施例，所述原核细胞包括细菌或藻。其中，所述细菌可以为大肠杆菌(如：e.coli bl21)。

46、根据本发明的一些实施例，所述真核细胞包括真菌(如酵母)、哺乳动物细胞(如hek293细胞)或昆虫细胞。

47、根据本发明的第六方面实施例的一种进行等温扩增反应的方法，包括以本发明第一方面实施例中所述的bst dna聚合酶突变体或本发明第二方面实施例中所述的重组蛋白作为dna聚合酶进行等温扩增反应的步骤。

48、根据本发明的一些实施例，具体可以包括以下步骤：

49、将所述bst dna聚合酶突变体、模板dna、引物与反应预混液混合，反应。

50、根据本发明的第七方面实施例的应用。

51、根据本发明的一些实施例，所述应用为c1)至c4)任一项在制备等温扩增产品中的应用，

52、c1)、本发明第一方面实施例中所述的bst dna聚合酶突变体；

53、c2)、本发明第二方面实施例中所述的重组蛋白；

54、c3)、本发明第三方面实施例中所述的生物材料；

55、c4)、本发明第四方面实施例中所述的酶制剂。

56、根据本发明的一些实施例，所述等温扩增包括lamp、依赖核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification，nasba)、滚环扩增技术(rolling circleamplification，rca)、单引物等温扩增技术(single primer isothermal amplification，spia)、依赖解旋酶dna等温扩增技术(helicase-dependent isothermal dnaamplification，hda)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)或链替代扩增(strand displacement amplification，sda)。

57、根据本发明的一些实施例，所述应用为本发明第一方面实施例中所述的bst dna聚合酶突变体、本发明第二方面实施例中所述的重组蛋白或本发明第三方面实施例中所述的酶制剂在等温扩增中的应用。

58、根据本发明的第八方面实施例的一种试剂盒，包括上述bst dna聚合酶突变体、上述重组蛋白或上述酶制剂。

59、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。