一种双菌发酵用于提高谷氨酰胺转氨酶酶活的方法

本发明属于生物工程，具体涉及一种双菌发酵用于提高谷氨酰胺转氨酶酶活的方法。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase，ec2.3.2.13，tgase)，它能催化蛋白质或多肽链中谷氨酰胺残基上的γ-胺基与赖氨酸残基上的ε-氨基或其他含氨基底物上的氨基发生转氨基反应，或与水发生脱氨基反应，可以通过催化氨基酸残基的交联和脱酰胺作用和食品表面结合来改变食品蛋白的功能特性。近年来tgase在其他方面的应用也受到了广泛的研究，涉及蛋白质工程、药物工程、组织工程、毛纺织工业和皮革加工业。包括在蛋白质工程方面有广泛的应用潜力，对蛋白质进行修饰，改善性能。

3、自1989年ando等筛选获得了一株能够分泌tgase的 streptomyces mobaraensis，目前微生物发酵已成为工业生产tgase的主要方式。 s. mobaraensis先以酶原的形式分泌pro-tgase，活性酶位于酶原的n端，长度为45aa；同时分泌两种蛋白酶：谷氨酰胺转氨酶活化蛋白酶(transglutaminase activating metalloprotease，tamep)和一种钙离子依赖的三肽基氨基肽酶(tripeptidyl amino peptidase，tap)；这两种酶参与了tgase的转录后修饰和活化过程。

4、目前，发酵工业生产tgase的过程中，存在着活性不够高的不足。tgase产能的提升，只能依靠发酵规模的扩大来实现。公开的论文和专利中，都采用了重组菌株共表达、外源添加或固定化蛋白酶的方法，并且声称有良好的效果。外源宿主表达的是没有活性的酶原形式pro-tgase，需要后期添加额外的蛋白酶进行活化处理，或者，需要在宿主中共表达酶原激活蛋白酶才会获得活性，这无疑又增加了谷氨酰胺转氨酶的生产成本和宿主的代谢负担。利用基因工程筛选获得高产tgase的菌株所需时间长，步骤复杂，不利于tgase的低成本大规模化生产。

5、pro-tgase在胞外不仅可以被自身的tamep及tap切割和修饰，还可以被还可以被胰蛋白酶、中性蛋白酶等修饰，得到具有催化活性的tgase。在发酵液中添加相应的蛋白酶，反应后测得的tgase活性更高。这表明在茂原链霉菌生产tgase的发酵液中，存在一定量的未被修饰活化的pro-tgase。然而，高纯度的蛋白酶需要经过纯化获得，且蛋白酶易受温度变化影响导致失活，蛋白酶的制备和储存成本也提高了tgase的生产成本和工艺精度。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种双菌发酵用于提高谷氨酰胺转氨酶酶活的方法。本发明采用能产生中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌( bacillus  amyloliquefaciens)和产生谷氨酰胺转氨酶的茂原链霉菌( streptomyces mobaraensis)共培养，提高谷氨酰胺转氨酶酶活。通过菌种的活化、驯化和其次双菌按初始接种比例，双菌相对接种时间的确定和发酵培养基浓度的确定防止双菌体系中的菌株产生竞争作用，使解淀粉芽孢杆菌产生中性蛋白酶对茂原链霉菌产生的谷氨酰胺转氨酶酶原进行修饰，来提高发酵液中谷氨酰胺转氨酶酶活。

2、为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

3、第一方面，本发明提高了一种双菌发酵用于提高谷氨酰胺转氨酶酶活的方法，包括以下步骤：

4、s1、取茂原链霉菌和解淀粉芽孢杆菌在固体培养基中划线培养，培养后挑取单菌落到液体培养基中活化培养，得到活化的茂原链霉菌和活化的解淀粉芽孢杆菌；

5、s2、活化的茂原链霉菌转接到种子培养基中培养获得茂原链霉菌种子液，活化的解淀粉芽孢杆菌转接到液体培养基中培养获得解淀粉芽孢杆菌种子液；

6、s3、将培养解淀粉芽孢杆菌种子液的培养基离心去除菌体后的上清液与种子培养基混合并灭菌，接种茂原链霉菌种子液培养后得到驯化后的茂原链霉菌种子液；将培养茂原链霉菌种子液的培养基离心去除菌体后的上清液与种子培养基混合并灭菌，接种解淀粉芽孢杆菌种子液培养后得到驯化后的解淀粉芽孢杆菌种子液；

7、s4、将驯化后的茂原链霉菌种子液接种至共培养发酵培养基，接种后将驯化后的解淀粉芽孢杆菌种子液接种至共培养发酵培养基进行发酵，用于生产谷氨酰胺转氨酶。

8、优选的，步骤s1中，茂原链霉菌使用的固体培养基包括高氏一号固体培养基，划线的温度为28～30 ℃，培养时间为4~6天，使用的液体培养基包括高氏一号液体培养基，活化培养具体为29~31 ℃下180～200 rpm摇床培养23~25 h。

9、优选的，步骤s1中，解淀粉芽孢杆菌使用的固体培养基包括lb固体培养基，划线培养的温度为28～30 ℃，培养时间为23~25 h，使用的液体培养基包括lb液体培养基，活化培养具体为29~31 ℃下180～200 rpm摇床培养19~21 h。

10、优选的，步骤s2中，活化的茂原链霉菌的接种量为4%~10% v/v，28～30 ℃下180～200 rpm培养23~25 h。

11、优选的，步骤s2中，液体培养基包括lb液体培养基，活化的解淀粉芽孢杆菌的接种量为4%~10% v/v，28～30 ℃下180～200 rpm培养19~21 h。

12、优选的，步骤s3中，培养解淀粉芽孢杆菌种子液的培养基离心去除菌体后的上清液和种子培养基的混合体积比为1:2，以4%~10%(v/v)接种量接种茂原链霉菌种子液，接种茂原链霉菌种子液后28～30℃下180～200 rpm培养23~25 h，培养2轮。

13、优选的，步骤s3中，培养茂原链霉菌种子液的培养基离心去除菌体后的上清液和种子培养基的混合体积比为1:2，以4%~10%(v/v)接种量接种解淀粉芽孢杆菌种子液，接种解淀粉芽孢杆菌种子液后28～30℃下180～200 rpm培养19~21 h，培养2轮后用无菌生理盐水稀释至od6000.6±0.05。

14、优选的，步骤s4中，驯化后的茂原链霉菌种子液和驯化后的解淀粉芽孢杆菌种子液的体积比为(1~1000):1，接种后0~24 h将驯化后的解淀粉芽孢杆菌种子液接种，发酵温度为29~31 ℃，发酵时搅拌速度为190~210 rpm，发酵时间为36~84 h。

15、进一步优选的，驯化后的茂原链霉菌种子液和驯化后的解淀粉芽孢杆菌种子液的体积比为100:(0.7~1.2)。

16、优选的，发酵过程中，经过滤除菌的空气以0.25~1 vvm速率供给，溶氧控制在25％以上，加0.5m h2so4或1m naoh控制ph 7.0±0.2。

17、上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：

18、本发明通过对于茂原链霉菌和解淀粉芽孢杆菌的种子活化和驯化以及特定比例的双菌接种，解决了双菌单纯混合发酵过程不稳定，重现性不佳的问题。

19、本发明实现了稳定的混合培养，与单菌发酵技术相比，能够提高谷氨酰胺转氨酶酶活25%以上，降低生产成本，提升单位生产效能，具有明显的实际应用价值和经济效益。