一种耳后皮肤来源的成纤细胞的培养方法及培养基与流程

本发明属于细胞培养，具体而言，涉及一种耳后皮肤来源的成纤细胞的培养方法及培养基。

背景技术：

1、皮肤的成纤维细胞广泛分布于真皮组织中，可通过自分泌或旁分泌的方式分泌细胞生长因子、胶原蛋白、应激蛋白及其他胞外蛋白，这些细胞分泌的营养物质可协同作用于皮肤，刺激皮肤组织中透明质酸、胶原蛋白、弹性蛋白的再生，修复受损细胞，促进创面愈合。成纤维细胞在人的一生中发挥重要作用，如在胚胎期指导皮肤形成，器官成熟后参与皮肤稳态的维持，促进损伤部位结构与功能的修复等。因此，体外培养自体皮肤成纤维细胞在组织工程，美容，医疗等领域具有很广泛的应用。

2、目前，体外培养成纤维细胞方法中使用的培养基主要由基础培养基和胎牛血清配置而成。胎牛血清的使用会带来动物源性病原体风险，影响临床应用的安全性；同时，培养周期长，易造成细胞原代活性差。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种耳后皮肤来源的成纤细胞的培养方法及培养基。本发明的成纤维细胞培养方法及培养基能够实现成纤维细胞的快速增殖培养，缩短培养时间。

2、本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

3、本发明的一个方面提供了一种耳后皮肤来源的成纤维细胞培养基，所述培养基的组成包括：基础培养基和外源添加物组合物，所述基础培养基包括以下之一：

4、（i）dmem培养基；

5、（ii）f12培养基；

6、（iii）dmem培养基与f12培养基按照体积比为1~2:1~2组成的混合培养基；

7、所述外源添加物组合物包括谷氨酰胺10~50 ng/ml、地塞米松1~10µm、香芹酚10~50 ng/ml、成纤维细胞生长因子1~20 μg/ml、表皮细胞生长因子1~20 μg/ml、异丙肾上腺素1~5µm、阿魏酸1~5 ng/ml、转铁蛋白100~200μg/ml、转化生长因子-β 1~10μg/ml和六肽-2 1~5 ng/ml。

8、本发明的另一个方面还提供了一种耳后皮肤来源的成纤维细胞培养基的制备方法，所述制备方法包括：

9、提供以下基础培养基之一：

10、（i）dmem培养基；

11、（ii）f12培养基；

12、（iii）dmem培养基与f12培养基按照体积比为1~2:1~2组成的混合培养基；

13、将外源添加物组合物加入到上述基础培养基中混合均匀，并在121-122℃下灭菌处理20-25min。

14、本发明的又一个方面还提供了一种耳后来源的成纤细胞的培养方法，采用前述的耳后皮肤来源的成纤维细胞培养基进行培养，所述培养方法包括以下步骤：

15、s1：组织采集：无菌条件下取耳后皮肤组织剪碎，然后置于消化酶液中消化，消化后离心，将所得细胞洗涤、离心，重复3次，得到细胞悬液；

16、s2：原代培养：使用原代培养基重悬细胞，使细胞浓度为2~4×105个/ml，在含有5％co2、37℃的培养箱中培养5-10天，其中，每隔2-3天换一次培养基；

17、s3：成纤细胞的扩增培养：将步骤s2中的原代培养结束后弃去培养基，加入1~2ml分散酶37℃下静置30min，然后离心弃去上清，再使用1~2ml胰蛋白酶-edta消化5min，然后使用成纤维细胞培养基重悬细胞得到浓度为1~4×105个/μl的细胞悬液10~20μl，再加入25~40μl增殖基质胶混合，待增殖基质胶凝固后，再次加入1~2ml的成纤维细胞培养基，最后在含有5％co2、37℃的培养箱中培养10~15天，其中，培养期间每隔2~3天换一次培养基。

18、在本发明的一个优选实施例中，步骤s1中所述消化酶液组成为：92~95 μl pbs缓冲液、1.5~2 μl 20 mg/ml ii型胶原酶、2~3μl 15 mg/ml细胞裂解酶和1.5~3μl 50 mm氯化钠；

19、所述消化酶液按照每1mg耳后皮肤组织加入100μl消化酶液的量加入；

20、所述消化条件为：37℃，30min。

21、在本发明的一个优选实施例中，步骤s2中所述原代培养基的组成包括：基础培养基和外源添加物组合物，所述基础培养基包括以下之一：

22、（i）dmem培养基；

23、（ii）f12培养基；

24、（iii）dmem培养基与f12培养基按照体积比为1~2:1~2组成的混合培养基；

25、所述外源添加物组合物包括谷胱甘肽10~20 μg/ml、氢化可的松1~10µm、碱性成纤维细胞生长因子1~10 ng/ml、重组人表皮细胞生长因子1~10 ng/ml、异鼠李素1~5ng/ml、肌醇六磷酸1~10 ng/ml、类胰岛素生长因子-ii 5~20 ng/ml、磷酸腺苷 50~150 ng/ml、皮质醇20~50 ng/ml、转化生长因子-β 10~20ng/ml、白细胞介素il-1 1~5 ng/ml、硫酸亚铁 2~15 ng/ml和精氨酸 1~5 μg/ml。

26、在本发明的一个优选实施例中，步骤s3中所述增殖基质胶的制备方法包括：

27、将明胶溶解于水中得到质量含量为40~60%的胶液，然后加入磷酸氢二铵，在150~200℃下加热反应1~3h，待反应结束后冷却至室温，得到改性明胶；

28、将所得改性明胶与n,n-二甲基甲酰胺、乙烯基磺酸盐单体按照质量比1:50~100:1~10的量混合均匀，在引发剂的存在下，40~60℃下反应2~6h，保持温度不变再加入硅烷偶联剂反应1~5h，待反应结束后冷却至室温，静置2~6h，随后抽滤，将所得胶状物采用去离子水洗涤，得到所述增殖基质胶。

29、在本发明的一个优选实施例中，所述明胶与磷酸氢二铵按照质量比1:0.02~0.04的量加入。

30、在本发明的一个优选实施例中，所述引发剂选自过硫酸钠、过硫酸钾、过硫酸钠中的任一种；所述引发剂的加入量为改性明胶质量的0.03-0.05倍。

31、在本发明的一个优选实施例中，所述乙烯基磺酸盐单体选自2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠、烯丙基磺酸钠、苯乙烯磺酸钠和羟乙烯基磺酸钠中的至少一种。

32、在本发明的一个优选实施例中，所述硅烷偶联剂选自乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷中的任一种，所述硅烷偶联剂的加入量为改性明胶质量的0.1-0.3倍。

33、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：

34、1、本发明提供了两种培养基，一种为原代培养基，另一种为增殖培养基，本发明所提供的培养基均未添加外源血清，有效避免了动物性病原体风险，同时降低了培养基成本，有利于细胞的规模化培养。

35、2、本发明的培养基在原有的基础培养基上添加组合细胞生长因子、激素、酚类、多肽、氨基酸、抗氧化剂等，各种组分之间通过合理配伍，有利于维持和刺激成纤细胞增殖和活性，与含血清培养基相比，本发明的培养基在培养成纤维细胞时，表现出更好的增殖活性。

36、3、本发明还提供了一种用于成纤维细胞增殖培养过程中的增殖基质胶，本发明的增殖基质胶以明胶为原料，通过高温下磷酸二氢铵的改性作用，使得明胶分子的结构发生变化，得到改性明胶，随后在功能单体的作用下引发自由基聚合反应，硅烷偶联剂能够帮助聚合物分子间重新形成新的三维空间结构，得到的产品用于成纤维细胞增殖过程中，能够保持细胞的活性，同时降低外界环境的影响，维持较优的培养环境，提高细胞的成活率。

37、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。