大豆免疫负调控基因海藻糖酶GmTRE、其编码蛋白及应用

本发明属于作物遗传育种，具体涉及大豆免疫负调控基因海藻糖酶gmtre、其编码蛋白及应用。

背景技术：

1、大豆作为世界上最重要的粮食和经济作物之一，在人类食物供给和能源保障中处于不可或缺的地位。作为一种连年种植的作物，大豆在生产上持续面临着多种病害的危害，包括大豆疫霉根腐病、大豆孢囊线虫病、病毒病等，这也是制约我国大豆产量和品质提升的重要因素之一。其中，由大豆疫霉菌(phytophthora sojae)引起的大豆根腐病是大豆生产上的一种毁灭性病害。大豆根腐病是一类土传病害，可以引起根腐、根茎腐、果腐、溃疡、萎焉和斑点等症状，其传播速度快，严重时可以导致植物绝产或者植株灭绝。农业生产上，根腐病的控制主要依赖于含有甲霜灵的化学杀菌剂的使用和抗病品种的种植。相较于传统农药的防治，培育抗病品种，是控制植物病害更为环保、健康、有效的策略。然而由于田间大豆疫霉菌生理小种变异快速、毒力结构复杂等原因导致了大豆品种抗性在生产上经常丧失。这些原因使得挖掘大豆参与免疫反应过程的新的基因显得尤为重要，也因此，开展大豆抗疫病机理的研究以及开发新的大豆抗性种质资源成为极具有挑战性和实用性的热点领域。

2、海藻糖是一种非还原性双糖，由两个吡喃型葡萄糖单体以1,1糖苷键连结而成，化学名称为α-d-吡喃葡糖基-α-d-吡喃葡糖苷(α-d-glucopyranosyl-α-d-glucopyranoside)。海藻糖由尿苷二磷酸葡萄糖(udp-g)和葡萄糖-6-磷酸(g6p:glucose-6-phosphate)在海藻糖-6-磷酸合成酶(tps：trehalose phosphate synthase)的催化作用下合成海藻糖-6-磷酸(t6p trehalose-6-phosphate)，海藻糖-6-磷酸(t6p)在海藻糖-6-磷酸磷酸化酶(tpp：trehalose-6-phosphate phosphatase)的催化作用下合成海藻糖(trehalose)，海藻糖又可在海藻糖酶(trehalase)的催化下，分解生成两分子的葡萄糖(glucose)。海藻糖普遍存在于细菌、酵母菌、动物和植物中，但与机体内参与代谢反应的其他糖类如蔗糖、果糖、葡萄糖等相比，它在生物体中的含量极低，尤其是在高等植物中。海藻糖在自然界中结构稳定，具有强非还原性，能经受得起热刺激或者酸刺激，且不被一般的酶所分解，只能被特异性的海藻糖酶水解，是天然双糖中相对比较稳定的糖类。

3、海藻糖酶是一种海藻糖水解酶，能够专-性并特异性的将1分子海藻糖分解为2分子的葡萄糖。自然界中，海藻糖酶广泛存在于昆虫、哺乳动物、微生物和植物中并发挥着重要的作用。昆虫体内的海藻糖不能被一般的酶水解,海藻糖酶是昆虫体内唯一一种能分解海藻糖的酶海藻糖酶，又称海藻糖水解酶，分解产生的葡萄糖经过糖酵解途径生成丙酮酸进人三羧酸循环，并最终氧化形成水和二氧化碳，这个最普遍的降解过程能够为昆虫的飞行和生长发育提供能量。在发育的特殊时期，昆虫体内的海藻糖会一直保持在一个较高水平，通过影响几丁质的合成，对昆虫的生长发育起着至关重要的作用。海藻糖酶在高等植物中也普遍存在。有趣的是，在水稻和拟南芥的基因组中只发现了一个海藻糖酶基因。到目前为止，关于海藻糖酶功能的研究较少。有研究表明，水稻中海藻糖酶基因(ostre1；os10g0521000)，可能参与耐盐胁迫。在拟南芥中，海藻糖和海藻糖酶可能在调节植物中碳水化合物的分配中发挥作用。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：如何提高大豆对大豆疫霉的抗性。

2、为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供蛋白质或调控基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述a1-a7)任一项中的应用，所述基因编码所述蛋白质，所述蛋白质可为gmtre蛋白；

3、a1)、在调控植物抗病性中的应用；

4、a2)、在制备调控植物抗病性的产品中的应用；

5、a3)、在调控植物疫霉抗性中的应用；

6、a4)、在制备调控植物疫霉抗性的产品中的应用；

7、a5)、在调控植物大豆疫霉抗性中的应用；

8、a6)、在制备调控植物大豆疫霉抗性的产品中的应用；

9、a7)、在植物育种或植物辅助育种中应用；

10、所述gmtre蛋白可为如下a1)-a3)任一种蛋白质：

11、a1)、氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

12、a2)、将a1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的氨基酸序列具有80％以上同一性，且与植物抗病性相关的蛋白质；

13、a3)、在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。

14、上述应用中，所述植物育种或植物辅助育种的目的为制备大豆疫霉抗性的植物。

15、进一步地，上述应用中，所述gmtre蛋白来源于大豆。

16、其中，seq id no.1由580个氨基酸残基组成。

17、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

18、所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag蛋白标签、his蛋白标签、mbp蛋白标签、ha蛋白标签、myc蛋白标签、gst蛋白标签和/或sumo蛋白标签等。

19、进一步地，上述的应用中，调控所述蛋白质编码基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

20、b1)、抑制或降低上述应用中所述基因的表达或上述应用中所述gmtre蛋白的活性的核酸分子；

21、b2)、含有b1)所述核酸分子的表达盒；

22、b3)、含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

23、b4)、含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

24、b5)、含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

25、b6)、含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织或含有b3)所述重组载体的转基因植物组织；

26、b7)、含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官或含有b3)所述重组载体的转基因植物器官；

27、b8)、编码上述应用中所述gmtre蛋白的核酸分子；

28、b9)、含有b8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

29、进一步地，上述的应用中，b1)所述核酸分子可为表达靶向上述应用中的所述基因的grna的dna分子或为靶向上述应用中的所述gmtre蛋白编码基因的grna；

30、进一步地，上述的应用中，b8)所述核酸分子可为如下g1)-g3)任一项所述的dna分子：

31、g1)、编码链的编码序列是序列表中序列2的dna分子；

32、g2)、编码链的核苷酸序列是序列表中序列3的dna分子；

33、g3)、与g1)或g2)所述dna分子具有80％以上的同一性，且调控植物抗病性的dna分子。

34、进一步地，上述的应用中，b1)所述grna的靶标序列选自t1)-t4)中任一种：

35、t1)、核苷酸序列如下的dna分子：5’-caacccctcttctctcctt-3’(seq idno.3第341-359位，位于第1外显子，也即seq id no.2第104-122位)；

36、t2)、核苷酸序列如下的dna分子：5’-tcgaaaccttcgcccattc-3’(seq idno.3第386-404位，位于第1外显子，也即seq id no.2第149-167位)；

37、t3)、核苷酸序列如下的dna分子：5’-gacttacatacgctgctcc-3’(seq idno.3第718-736位，位于第1外显子，也即seq id no.2第481-499位)；

38、t4)、核苷酸序列如下的dna分子：5’-tggttcggttgtcattccc-3’(seq idno.3第744-762位，位于第1外显子，也即seq id no.2第507-525位)。

39、进一步地，上述的应用中，所述植物选自下述任一种：

40、c1)、双子叶植物；

41、c2)、豆科植物；

42、c3)、大豆属植物；

43、c4)、大豆。

44、上述相关生物材料中，b9)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达蛋白质gmtre的dna，该dna不但可包括启动gmtre基因转录的启动子，还可包括终止gmtre基因转录的终止子。

45、上述相关生物材料中，b4)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。

46、上述相关生物材料中，b6)所述植物组织可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。

47、上述相关生物材料中，b7)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。

48、上述相关生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。

49、为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供一种调控大豆对大豆疫霉抗性的方法，所述方法包括m1)或m2)：

50、m1)、通过调控受体大豆中所述gmtre蛋白的表达或调控所述gmtre蛋白的活性或含量，来调控大豆对大豆疫霉的抗性；

51、m2)、通过对受体大豆施用井冈霉素来提高受体大豆的大豆疫霉抗性。

52、进一步地，上述的方法中，m1)所述方法包括m1-1)或m1-2)，

53、m1-1)、向受体大豆中导入上述应用中所述grna的基因和cas蛋白的编码基因来抑制或降低所述受体大豆中所述gmtre蛋白编码基因的表达或抑制或降低所述受体大豆中所述gmtre蛋白的活性或含量，得到大豆疫霉抗性高于所述受体大豆的目的大豆；

54、m1-2)、向受体大豆中导入上述应用中b8)所述的核酸分子来促进或提高所述受体大豆中所述gmtre蛋白编码基因的表达或促进或提高所述受体大豆中所述gmtre蛋白的活性或含量，得到大豆疫霉抗性低于于所述受体大豆的目的大豆。

55、为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供一种制备大豆疫霉改变的大豆的方法，所述方法包括m1-1)或m1-2)：

56、m1-1)、向受体大豆中导入上述应用中所述grna的基因和cas蛋白的编码基因来抑制或降低所述受体大豆中所述gmtre蛋白编码基因的表达或抑制或降低所述受体大豆中所述gmtre蛋白的活性或含量，得到大豆疫霉抗性高于所述受体大豆的目的大豆；

57、m1-2)、向受体大豆中导入上述应用中b8)所述的核酸分子来促进或提高所述受体大豆中所述gmtre蛋白编码基因的表达或促进或提高所述受体大豆中所述gmtre蛋白的活性或含量，得到大豆疫霉抗性低于于所述受体大豆的目的大豆。

58、进一步地，上述的方法中，所述受体大豆可为大豆的细胞、组织、器官或植株。

59、在本发明的一个实施例中，所述受体大豆为大豆分化的毛状根(发状根)。

60、为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供上述应用中的所述蛋白质或/和上述应用中的所述生物材料。

61、本发明中，所述cas蛋白可为cas9蛋白。

62、本发明中，所述大豆疫霉的致病菌可为大豆疫霉(phytophthora sojae)。

63、在本发明的一个实施例中，所述大豆疫霉的致病菌可为大豆疫霉(phytophthorasojae)菌株rfp-p6497。

64、本发明中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

65、本发明中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

66、本发明中，所述调控可为上调或增强或提高，也可为下调或抑制或降低。

67、本发明中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为敲除所述蛋白质的编码基因的物质和/或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质。

68、本发明中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

69、本发明中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

70、所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。

71、所述基因沉默是指在不损伤原有dna的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变dna序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活,包括反义rna、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。

72、本发明中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过crispr-cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。

73、本发明取得的有益技术效果如下：

74、大豆海藻糖酶基因gmtre能够通过提高植物体内海藻糖含量负调控植物免疫反应。本发明还发现通过对大豆施用tre抑制剂井冈霉素validamycin a可以抑制大豆疫霉侵染。本发明提供了gmtre基因在大豆抗病种质资源的遗传改良育种中的用途，具有良好的应用前景。