一种提高植物抗大豆疫病的基因GmPNGaseA及其应用

本发明属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，具体地说，本发明涉及一种提高植物抗病性的基因gmpngase a及其应用。

背景技术：

1、疫霉属于卵菌门，是一类进化独特的真核生物，能够侵染多种作物引起植物疫病，给全球农业生产和生态环境带来巨大威胁；由于其基因组复杂、变异迅速、遗传转化困难，对病原菌致病机理缺乏了解，严重制约疫病防控技术的研发。因此，揭示疫霉菌广谱致病机制、以病原菌核心致病因子为探针挖掘植物广谱抗病基因，可望为利用基因编辑等方法改良作物广谱、持久抗病性奠定核心理论基础。

2、质外体空间是病原菌和寄主进行互作和竞争的重要战场。在病原菌和寄主互作的过程中，植物在质外体与病原菌进行了多层次的“军备竞赛”并形成了一系列的防卫系统。在病原菌侵染早期，病原菌会分泌质外体效应子，调控植物免疫反应促进侵染，如：大豆疫霉质外体效应子psxeg1，在病菌侵染早期水解植物细胞壁中的半纤维素，促进疫霉菌侵染(ma,et al.2015；ma,et al.2017)；稻瘟病菌效应子moslp1能与植物几丁质识别受体竞争性结合几丁寡糖，抑制几丁寡糖被受体识别触发的免疫反应(mentlak,et al.2012)等。n-糖基化修饰是真核生物分泌蛋白中重要的转录后修饰之一(chung,et al.2017)。近期研究表明，糖基化修饰广泛分布于病原菌的效应子中，参与调控效应子的功能(liu,etal.2021)。如稻瘟病菌效应子moslp1与水稻受体蛋白oscebip竞争性结合几丁质寡糖，从而抑制水稻识别几丁质寡糖的免疫反应，这个过程需要效应子的n-糖化修饰(chen,etal.2014)；水稻孢囊线虫致病关键效应子mggpp抑制植物免疫反应的过程需要n-糖基化修饰(schneider,et al.2017)；这些研究结果均表明，在病原菌和寄主长期相互进化的过程中，n-糖基化修饰逐渐成为多数病原菌武装自身效应子的广谱致病机制。因此，鉴定植物质外体去n-糖基化酶基因，对改良作物广谱抗性具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供gmpngase a蛋白及其编码基因在提高植物免疫抗性或抗病性中的应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、第一方面，本发明提供gmpngase a蛋白或促进所述gmpngase a蛋白编码基因表达的物质或提高所述gmpngase a蛋白活性或含量的物质在如下al)或a2)中的应用：

4、al)提高植物免疫抗性或抗病性；

5、a2)培育免疫抗性或抗病性提高的植物新种质；

6、所述gmpngase a蛋白为如下bl)-b3)任一种蛋白质:

7、bl)氨基酸序列是seq id no.2的蛋白质；

8、b2)将seq id no.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物免疫抗性或抗病性相关的蛋白质；

9、b3)与bl)或b2)所示的蛋白质具有80％以上同一性且与植物免疫抗性或抗病性相关的蛋白质。

10、本发明中，所述80％以上的同一性可为至少80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％的同一性。

11、进一步，上述的应用中，所述的促进gmpngase a蛋白编码基因表达或提高所述gmpngase a蛋白活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料为下述cl)～c7)任一种:

12、cl)编码所述gmpngase a蛋白的核酸分子；

13、c2)含有cl)所述核酸分子的表达盒；

14、c3)含有cl)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；

15、c4)含有cl)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；

16、c5)含有cl)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有c3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

17、c6)含有cl)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有c3)所述重组载体的转基因植物组织；

18、c7)含有cl)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有c3)所述重组载体的转基因植物器官。

19、进一步，上述的应用中，编码所述gmpngase a蛋白的核酸分子为如下d1)或d2)所示的dna分子:

20、d1)具有如seq id no.1所示的核苷酸序列的dna分子；

21、d2)与d1)所述dna分子具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna分子。优选为，与d1)所述dna分子具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna分子；进一步优选为，与d1)所述dna分子具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna分子。

22、本发明中，所述70％以上的同源性可为至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％的同一性。

23、本发明的具体实施例中，所述的重组载体为重组表达载体，所述的重组表达载体是将所述的基因gmpngase a或密码子优化的基因插入到含有c-端egfp的双元载体pbin-egfp酶切位点smai中得到的载体pbin-gmpngase a-egfp。

24、本发明中，使用上述的基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。

25、本发明中，所述的重组微生物是由所述的重组表达载体导入宿主细胞所得，所述的宿主细胞优选大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

26、本发明中，为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记等。

27、进一步，上述的应用中，所述的提高植物免疫抗性或抗病性是提高植物对致病菌的免疫抗性或提高植物抗致病菌引起的病害；所述的致病菌为能够侵染主要粮食及经济作物的致病菌：卵菌、真菌或细菌。更近进一步，所述的致病菌为疫霉菌、镰刀菌、稻瘟菌等易引起的植物病害的致病菌中的至少一种。

28、进一步，上述的应用中，所述植物为大豆、烟草、番茄或马铃薯中的至少一种。

29、第二方面，本发明提供一种提高植物免疫抗性或抗病性的方法，该方法包括促进受体植物中所述gmpngase a蛋白的编码基因表达或提高受体植物中所述gmpngase a蛋白的活性或含量。

30、进一步，上述方法包括向所述受体植物中导入所述gmpngase a蛋白的编码基因，所述gmpngase a蛋白的编码基因为如下d1)或d2)所示的dna分子:

31、d1)具有如seq id no.1所示的核苷酸序列的dna分子；

32、d2)与d1)所述dna分子具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna分子；优选为，与d1)所述dna分子具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna分子；进一步优选为，与d1)所述dna分子具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna分子。

33、第三方面，本发明提供一种制备免疫抗性或抗病性提高的植物新种质的方法，该方法包括向受体植物中导入gmpngase a蛋白的编码基因，得到免疫抗性或抗病性提高的目的植物；所述gmpngase a蛋白的编码基因为如下d1)或d2)所示的dna分子:

34、d1)具有如seq id no.1所示的核苷酸序列的dna分子；

35、d2)与d1)所述dna分子具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna分子；优选为，与d1)所述dna分子具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna分子；进一步优选为，与d1)所述dna分子具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna分子。

36、本发明中向受体植物中导入gmpngase a蛋白的编码基因(包括基因gmpngase a，包含有基因gmpngase a的表达盒、重组表达载体、转基因植物系或转基因重组菌)导入作物后能够获得显著抗病性/或增加产量的作物品种，优选导入大豆、烟草、番茄或马铃薯中获得能够增强抗病性和/或增加产量的作物品种。

37、第四方面，本发明提供上述应用中的gmpngase a蛋白或上述应用中的生物材料。

38、本发明中，用于扩增所述基因gmpngase a的全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。用于扩增基因gmpngase a全长的引物对包括正向引物f和反向引物r；所述正向引物f的序列如seq id no.3所示；所述反向引物r的序列如seq id no.4所示。

39、本研究对大豆细胞外泌液的分析发现天冬氨酸蛋白酶gmpngase a参与大豆抵抗大豆疫霉侵染过程。在过表达gmpngase a基因的大豆上接种大豆疫霉，造成的大豆疫霉生物量显著减少。gmpngase a基因对大豆抗病性起着非常重要的作用，对大豆中gmpngase a的研究可带动许多其它植物如番茄和马铃薯胞外抗病蛋白的相关研究，可为抗病基因工程育种提供优秀的抗病基因资源。

40、本发明的有益效果：

41、本发明所述gmpngase a蛋白通过分泌到胞外发挥抗病作用，从而增强植物抗病性，尤其对疫霉菌的抗病具有广谱性，可以显著增强植物对疫霉菌的抗病性，本发明可以运用在作物育种抗病性改良方面，有望提高植物对疫病的抗病性，进而促进农药化肥减施增效。