OsARF24基因在调控水稻种子粒型中的应用

本发明涉及生物，具体涉及osarf24基因在调控水稻种子粒型中的应用。

背景技术：

1、水稻(oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一，是世界上一半以上的人口的主食。如何在有限的土地上种植出产量更高的粮食作物一直是研究的热点。决定水稻产量的3个主要因素为：单株有效穗数、每穗结实率和粒重。其中，穗数是水稻产量的基础；结实率决定每穗粒数；粒重与粒型相关性状如粒长、粒宽、粒厚和籽粒饱满度密切相关。因此，粒型是水稻增产的重要农艺性状。

2、生长素参与植物生长发育的各个阶段以及植物应对生物、非生物胁迫的响应。在植物中，生长素通过调节基因表达来调控生长发育。经典转导途径为生长素剂量依赖性转录抑制物的降解，进而实现转录抑制到基因激活的快速转换。生长素信号转导过程是从感知生长素与某种受体相互作用开始的，当生长素不存在或浓度低时，转录抑制子aux/iaa(auxin/indole acetic acid repressors)与结合在生长素响应基因上游生长素应答元件(auxin response element，auxre)上的arf(auxin response factor,arf)的二聚体结构域结合，抑制靶基因的转录。生长素浓度升高时，生长素结合于scf复合体(scftir1)的f-box蛋白tir1/afb(transprot inhibitor resistant1/auxin signaling f-box)上，稳定tir1-aux/iaa结构域；随后复合体上的rbx1蛋白将泛素激活酶e1转换为泛素连接酶e2，e2使aux/iaa泛素化后被26s蛋白体降解。失去了aux/iaa蛋白质抑制的arf蛋白质活化或形成更高级的二聚体，启动生长素响应基因的转录，表现出生理反应。

3、水稻中arf家族包含25个成员，其中osarf5、osarf6、osarf11、osarf12、osarf16、osarf17、osarf19、osarf21和osarf25为转录激活因子，其他蛋白为转录抑制因子。已有研究表明，osarf4负调节水稻籽粒大小和重量，其机制可能是osarf4在水稻籽粒发育过程中抑制了osiaa23和osiaa27的表达。osarf6突变体株系的表现出粒长和粒重显著增加，且osarf6的下游基因osaux3的功能缺失株系也具有同样表型。osarf 25突变体的粒长、千粒重、每株穗数和每穗粒数都显著小于野生型。osarf12的过表达株系的粒长、粒宽和千粒重均显著增加，rnai干扰的突变体株系呈现相反的情况。在粒长方面，osarf23突变体和过表达材料无明显变化。上述研究结果显示，水稻中不同的arf家族成员在水稻籽粒发育中发挥着不同的调控作用。关于osarf24对水稻粒型方面的影响尚未有研究报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种可调控水稻种子粒型的基因，通过基因编辑达到提高水稻产量的目的。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明利用crispr/cas9基因编辑敲除系统对水稻中osarf24基因进行编辑使得该基因编码的蛋白功能缺失，研究发现，对osarf24基因进行特异性敲除获得的阳性纯合株系，表现出籽粒长度变长，籽粒宽度变宽的表型，表明osarf24基因的重新编辑在改良水稻粒型中具有一定应用价值。

4、因此，本发明提供了osarf24基因在调控水稻种子粒型中的应用，所述osarf24基因的cds序列如seq id no.1所示或与seq id no.1所示序列具有70％以上同源性且编码的蛋白在功能上等价。

5、所述粒型包括籽粒的长度、宽度。

6、所述应用包括：利用生物学技术手段降低水稻中osarf24基因编码蛋白的表达或活性，进而获得籽粒增大的水稻突变体。

7、所述生物学技术手段可以为但不限于crispr/cas9基因编辑技术。

8、本发明利用上述方法获得了籽粒增大的水稻突变体，突变体中osarf24基因的cds序列如seq id no.5、seq id no.7或seq id no.9所示；编码的氨基酸序列如seq id no.6、seq id no.8或seq id no.10所示。

9、本发明还提供了一种籽粒增大水稻的育种方法，包括：利用crispr/cas9技术定点编辑核苷酸序列如seq id no.1所示的osarf24基因的靶位点，所述靶位点的序列分别为5’-gatgggaatgggagtggtaa-3’(seq id no.3)，5’-aggatcttcatggggttgag-3’(seq idno.4)。

10、具体地，将所述水稻osarf24基因靶位点连入crispr/cas9系统的表达载体中，构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到受体水稻材料中，培育获得粒型改良的基因编辑植株。

11、作为优选，所述的表达载体为prgeb32。

12、所述的育种方法，其特征在于，包括以下步骤：

13、(1)针对所述的靶位点和pgtr质粒序列分段设计pcr引物，以pgtr质粒为模板进行pcr扩增，获得含有pgtr质粒不同分段的三段pcr产物，将pcr产物回收并连接获得含所述靶位点序列的线性化片段；

14、(2)以线性化片段为模块，pcr扩增获得含所述靶位点序列的目标产物，将目标产物连入终载体prgeb32质粒，构建得到crispr/cas9重组载体；

15、(3)将crispr/cas9重组载体转入待基因编辑的受体水稻中，进行植物组织培养，筛选获得含有cas9序列标签的t0代阳性苗；

16、(4)t0代阳性苗自交一代得到t1代苗，通过筛选获得去除cas9标签的t1代苗，即得具有籽粒变大表型的水稻植株。

17、步骤(1)中，采用的pcr引物为：

18、l5ad5-f：5’-cgggtctcaggcaggatgggcagtctgggcaacaaagcaccagtgg-3’；

19、gr1-r：5’-atggtctcacccattcccatctgcaccagccgggaa-3’；

20、gr1-f：5’-taggtctcctgggagtggtaagttttagagctagaa-3’；

21、gr2-r：5’-cgggtctcatgaagatccttgcaccagccggg-3’；

22、gr2-f：5’-taggtctccttcatggggttgaggttttagagctagaa-3’；

23、l3ad5-r：5’-taggtctccaaacggatgagcgacagcaaacaaaaaaaaaagcaccgactcg-3’。

24、设计引物时，引入酶切位点，pcr扩增得到的三个片段，利用酶切产生粘性末端，在连接酶的作用下连接得到线性长片段。

25、步骤(2)中，采用的pcr引物为：

26、s5ad5-f：5’-cgggtctcaggcaggatgggcagtctgggca-3’；

27、s3ad5-r：5’-taggtctccaaacggatgagcgacagcaaac-3’。

28、步骤(3)中，将crispr/cas9重组载体转化到受体水稻(如愈伤组织)中，培育获得基因编辑植株t0代，利用扩增编码cas9蛋白基因序列的特异性引物，对基因编辑株系t0代基因组进行pcr扩增检测，从而筛选出含有cas9序列标签的基因编辑苗。

29、作为优选，受体水稻为粳稻。

30、步骤(4)中，基因编辑苗自交一代得到t1代苗，利用扩增编码cas9蛋白基因序列的特异性引物，对t1代苗进行pcr扩增检测，筛选出自交去除cas9标签的t1代苗。进一步地，筛选获得稳定纯合的t2代突变体水稻长粒型的植株。扩增编码cas9蛋白基因序列的特异性引物序列如下：

31、promoter u3:5’-tgggtacgttggaaaccacg-3’

32、pubi10:5’-gtttgttggtcgccgttagg-3’。

33、本发明具备的有益效果：

34、本发明通过基因编辑技术获得osarf24基因特异性敲除的水稻突变体，可用于分析osarf24基因在水稻中的生物学功能。该突变体表现出籽粒粒型增大的表型。本发明提供了osarf24基因在调控水稻粒型方面的研究新方向，在提高水稻产量方面具有应用价值。