PLAP-CAR-效应细胞的制作方法

本发明涉及plap(胎盘碱性磷酸酶)-car。本发明还涉及通过向患者施用plap-car-t细胞、plap-car-自然杀伤细胞，或plap-car-巨噬细胞来治疗plap阳性癌细胞的方法。

背景技术：

1、免疫疗法正在成为一种非常有前途的癌症治疗方法。t细胞或t淋巴细胞是我们免疫系统的武装力量，不断寻找外来抗原并将异常(癌症或经感染细胞)和正常细胞区分开来。利用car对t细胞进行基因修饰已成为设计肿瘤特异性t细胞最常见的方法。将靶向肿瘤相关抗原(taa)的car-t细胞输入患者体内(称为过继细胞转移或act)是一种有效的免疫治疗方法。与化疗或抗体相比，car-t技术的优点在于经重新编程的工程化t细胞能在患者体内实现增殖和持续存在(“一种活的药物”)。

2、car(嵌合抗原受体)通常由源自单克隆抗体的单链可变片段(scfv)组成，该单链可变片段通过铰链和跨膜结构域与可变数量的胞内信号共刺激结构域相连：(i)cd28、ox-40、cd137(4-1bb)、gitr，或其他共刺激结构域；和(ii)共刺激结构域后的单一细胞激活cd3-ζ结构域(图1)。car的演变经历了从第一代(无共刺激域)到第二代(有一个共刺激域)再到第三代car(有若干个共刺激域)。具有多个共刺激结构域的car(所谓的第三代car)可增强细胞溶解活性，并显著改善car-t细胞的持久性，从而增强其抗肿瘤活性。

3、自然杀伤(nk)细胞是cd56+cd3-大颗粒淋巴细胞，可以杀死经病毒感染和转化的细胞，是构成先天免疫系统的关键细胞亚群。与具细胞毒性的cd8+t淋巴细胞不同，nk细胞对肿瘤细胞产生细胞毒性不需要预先致敏，并且还可以根除mhc-i阴性细胞。

4、car-t细胞疗法在治疗血液系统肿瘤患者的临床中取得了成功[1-5]。嵌合抗原受体包含靶向癌细胞表面抗原的抗体的单链可变片段(scfv)，其与铰链、跨膜结构域、共刺激结构域(cd28，41-bb或其他结构域)和cd3激活结构域[1，6]、[7，8]连接。最近，基于两种cd19-car-t细胞疗法(kymriah和yescarta)在临床试验中对急性淋巴细胞白血病和其他血液系统肿瘤的高应答率，fda批准了它们用于治疗相应血液系统肿瘤[3]、[9-11]。还有若干种其他car-t细胞已开展临床试验，例如：用于b细胞淋巴瘤的cd22-car-t细胞[12]，用于多发性骨髓瘤的bcma-car-t细胞[13-14]等。

5、就实体瘤而言，由于脱靶(on-target off-tumor)效应、抑制性肿瘤微环境、进入肿瘤的car-t细胞减少、t细胞耗竭和低持久性等原因，car-t细胞疗法在靶向实体瘤方面仍面临许多挑战[15]、[16-18]。靶向实体瘤的car-t细胞面临的主要挑战是，大多数实体瘤的肿瘤抗原均在正常组织中表达。

6、plap

7、plap是一种由alpp基因编码的胎盘碱性磷酸酶。plap是一种催化磷酸单酯的水解的金属酶。plap主要在胎盘和子宫内膜组织中表达，在正常组织中不表达。

8、plap在胎盘中高表达[19]，并在除睾丸外的大多数正常组织中不表达[20]。现已发现它在恶性精原细胞瘤、畸胎瘤[20]、[21]、卵巢癌和宫颈癌[22]、[23]、[24]，和结肠腺癌[25]中过表达。在肺、胰腺和胃肿瘤中也检测到plap[39]。plap也在非小细胞肺癌患者外泌体中的其他几种膜结合蛋白中被检测到，并有可能成为预后标志物[26]。

9、人plap是alpp基因编码的535个氨基酸的糖基化蛋白，其1-22为信号肽，然后是胞外结构域(23-506)，513-529为跨膜结构域(序列如下所示，跨膜结构域标有下划线)uniprot数据库(www.uniprot.org/uniprot/p05187；nm_001632)。其序列如下所示(seq idno：1)。

10、

11、存在四种不同但相关的碱性磷酸酶：肠型(alpi)(nm_001631)；胎盘；胎盘样型(alppl2)(nm_031313)，均由2号染色体上基因编码；肝/骨/肾型(alpl)(组织非特异性)(nm_000478)，由1号染色体上的基因编码。

技术实现思路

技术特征：

1.一种包含vl和vh的plap(胎盘碱性磷酸酶)抗体或其抗原结合片段，其中vl具有如seq id no:22所示的氨基酸序列，vh具有如seq id no:21、26、30或34所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述vh具有如seq id no:21所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述vh具有如seq id no:26所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述vh具有如seq id no:30所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述vh具有如seq id no:34所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为单链可变片段(scfv)。

7.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述scfv具有如seq id no:23、8、18、27、31或35所示的氨基酸序列，或者具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，条件是该序列变化位于非cdr的框架区域。

8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述scfv具有如seq id no:23、8、27或35所示的氨基酸序列，或者具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，条件是该序列变化位于非cdr的框架区域。

技术总结本发明涉及一种嵌合抗原受体(CAR)融合蛋白，其从N‑末端到C‑末端包括：(i)含VH和VL的单链可变片段(scFv)，其中，scFv与人PLAP(胎盘碱性磷酸酶)结合，(ii)跨膜结构域，(iii)共刺激结构域CD28、OX‑40、GITR，或4‑1BB，和(iv)CD3激活结构域。本发明还涉及经修饰以表达本发明CAR的T细胞、自然杀伤(NK)细胞，或巨噬细胞。本发明进一步涉及通过向患者施用PLAP‑CAR‑T细胞、PLAP‑CAR‑NK细胞，或PLAP‑CAR‑巨噬细胞来治疗PLAP阳性癌细胞的方法。技术研发人员：吴力军,维塔·格鲁博斯卡娅受保护的技术使用者：湖南远泰生物技术有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18