一株贝莱斯芽孢杆菌MLY65及其应用的制作方法

本发明涉及农用生物防治菌剂领域，主要是涉及一株兼具组成型和诱导型合成泛革素(fengycin)能力，同时增殖速度慢的贝莱斯芽孢杆菌突变株mly65及其应用。

背景技术：

1、贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)是2005年才被认定的芽孢杆菌属新种。贝莱斯芽孢杆菌广泛分布于空气、土壤、江河湖泊、动物肠道、植物根系及组织等环境中，为需氧或兼性厌氧菌，有鞭毛，可运动。在盐浓度为12％，温度15～45℃，ph 5～10的培养条件下均可生长。虽然贝莱斯芽孢杆菌的发现时间短暂，但关于贝莱斯芽孢杆菌的研究报道却日益增多。国内外研究表明，贝莱斯芽孢杆菌具有拮抗植物病原真菌和细菌作用，是一种高效的、可以开发利用的新型生防细菌，在生物防治上具有无限挖掘潜力。已见报道的贝莱斯芽孢杆菌菌株对柑橘炭疽病菌(colletotrichum gloeosporioides)、黄瓜蔓枯病菌(mycosphaerlla melonis)、烟草赤星病菌(alteraria alternata)、油菜核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)、松苗立枯病菌(rhizoctonia solani)、小麦根腐病菌(bipolaris sorokiniana)、辣椒疫霉病菌(phytophthora capsici)、烟草黑胫病菌(phytophtora parasitica)、灰霉病菌(botrytis cinerea)、胶孢炭疽菌、哈茨木霉、禾谷丝核菌、西瓜枯萎病菌、小麦根腐病菌、芹菜早疫病菌、花生果腐病菌、禾谷镰刀菌、哈锐炭疽菌(colletotrichum horri)香蕉枯萎病菌(fusarium oxysporum f.sp.cubense)、炭黑曲霉、魔芋软腐病致病菌pectobacterium aroidearum、迟缓爱德华氏菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、核桃细菌性黑斑病、粪肠球菌以及伤寒沙门菌等病原菌具有抑菌作用。贝莱斯芽孢杆菌对多种病原菌表现出的优良抑菌效应，表明其在植物保护领域，尤其是绿色生物防治领域具有广阔的应用前景。

2、贝莱斯芽孢杆菌的常见抑菌物质及其相关信息如下表所示。众多具有抑菌活性的代谢产物中，环脂肽类代谢产物的合成时期主要是平台期，如泛革素(fengycin)的累积就是发生在平台期。泛革素(fengycin)的结构主要包含一个由10个氨基酸所组成的环肽和一条脂肪酸链，经由非核糖体合成途径合成。在以往报道中，较多提及枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌合成泛革素的研究。贝莱斯芽孢杆菌合成泛革素研究多参考枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌相关文献。研究表明泛革素(fengycin)的合成为诱导型，且在进入生长曲线的平台期后方才开始合成。

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4、本发明所述菌株除保留野生型菌株于平台期诱导合成泛革素能力外，新获得了于生长曲线迟缓期和对数期组成型合成泛革素的能力，但同时细胞增殖速度出现了大幅度降低。高产活性成分同时慢速增殖，意味着该菌将更多的物质和能量消耗应用于活性成分，即泛革素的合成。在农业应用中，由于其生长速度慢，则在相同营养物质供应下可以保持更长的活性状态，有利于延长防效。

技术实现思路

1、本发明的首要目的是提供一株能够组成型表达高产抗真菌(尤其是烟草疫霉)活性成分-泛革素，且生长速度较慢的贝莱斯芽孢杆菌新菌株mly65。贝莱斯芽孢杆菌普遍生长速度较快，且到达平台期后才表达泛革素。但是在农田应用中，前期的快速生长对营养物质要求较高，达到平台期后土壤环境下不利于大量积累泛革素，最终会因快速生长导致土壤缺氧情况加剧，因泛革素累积不足导致防病效果不佳。在此情况之下，培育生长速度较慢、能够组成型合成泛革素的贝莱斯芽孢杆菌新菌株就具有切实的实际应用意义。

2、一株贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)mly65，保藏号为cgmcc no.25975。

3、所述的贝莱斯芽孢杆菌mly65，能够组成型和诱导型合成泛革素。

4、所述的贝莱斯芽孢杆菌mly65，增殖速度较野生型菌株降低，对数期细胞数量倍增所需时间为2h-10h。

5、所述的贝莱斯芽孢杆菌mly65，对烟草疫霉菌株具有非细胞接触性抑菌活性，平板有效抑制距离0.5-4.5cm。

6、本发明的第二个目的是提供所述的贝莱斯芽孢杆菌mly65的应用，用于抑制真菌。

7、进一步地，用于抑制疫霉，尤其是烟草疫霉。

8、本发明的第三个目的是提供所述的贝莱斯芽孢杆菌mly65发酵产泛革素培养基：蔗糖1.0-20.0g，十四醇0.5-10.0g，油酸0.5-10.0g，玉米浆粉0.5-10.0g，蛋白胨0.5-10.0g，谷朊粉1.0-10.0g，硝酸钠0.1-1.0g，硫酸镁0.1-1.0g，磷酸二氢钾0.5-3.0g，碳酸钙0.1-1.0g，硼酸10-200mg，钼酸钠10-200mg，氯化钴10-200mg，氧化锌10-200mg，氯化铜10-200mg，硫酸亚铁10-200mg，定容至1l。

9、本发明的第四个目的是提供所述的贝莱斯芽孢杆菌mly65合成泛革素的分离方法:发酵结束后先将发酵液降温到10℃-20℃，并静置0.5-6h；取静置后分离出的上层白色乳液，加入ph3.5-6.0质量百分比浓度为1.0％-10％的壳聚糖水溶液，搅拌均匀；所述的白色乳液与壳聚糖水溶液体积比10:1-1:10；于5000-12000转/分条件下离心收集沉淀；按沉淀湿重与正丁醇质量比1:0.5-1:5混合，并于40℃-65℃下搅拌萃取0.5h-2h；收集萃取处理后的沉淀，并加入乙醇-碳酸钠水溶液，其中碳酸钠水溶液的浓度为20-100mm，乙醇与碳酸钠水溶液的混合体积比为乙醇：碳酸钠水溶液＝5:5-9:1；萃取处理后的沉淀与乙醇-碳酸钠水溶液的质量比1:1-1:10混合，180-220转/分速度下持续搅拌提取0.5-8h；取反应后的乙醇-碳酸钠水溶液经1000道尔顿排阻分子量的透析袋于4-6倍体积的蒸馏水中透析过夜，透析袋内溶液经75-95℃烘干，即为mly65菌株发酵合成的泛革素。

10、本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌突变株mly65，由从土壤分离的野生型产泛革素贝莱斯芽孢杆菌菌株be01，经co60辐照育种法选育获得，能够组成型和诱导型合成泛革素；mly65菌株发酵终产物中进入平台期前后泛革素(fengycin)合成量的比例介于10:1-1:3之间，泛革素(fengycin)合成相关基因fenc表达量前后比值介于0.9-0.5之间，泛革素(fengycin)合成相关调控基因degq表达量前后比值介于1.0-0.1之间；选育过程中，通过挑取小菌落结合拮抗效果评价法筛选组成型高产泛革素，同时慢速生长的特殊贝莱斯芽孢杆菌新菌株，野生型菌株在适宜条件下对数期菌数倍增所需时间约为19.0分钟，突变株mly65倍增所需时间2-10h；与常规的筛选快速生长菌株不同，本发明反向筛选高抗真菌活性的慢速生长突变株，虽然该筛选策略会因菌种生长缓慢导致工业菌剂制备难度升高，但是能够显著延长菌剂的活力保持时长，延长拮抗烟草疫霉的持效期。

11、本发明有益效果

12、本发明突变株生长缓慢且能组成型合成抗真菌物质泛革素，因此在少量营养物质供应下，即可保持较长的有效抑制病害真菌生长的效果。对于开发同步包埋菌剂和营养物质的高效生防菌剂具有特别突出的有益效果，在植物保护、食品防腐、饲料防霉等方面具有广阔的应用前景。

13、本发明贝莱斯芽孢杆菌突变株mly65,分类命名：贝莱斯芽孢杆菌，拉丁学名：bacillus velezensis mly65，保藏号：cgmcc no.25975，保藏日期：2022年10月28日，保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：中国.北京.中国科学院微生物研究所。