DNA序列和培育抗黄萎病的棉花的方法

本发明属于生物，具体涉及培育抗黄萎病的棉花的。

背景技术：

1、棉花黄萎病严重威胁着棉花的生产和相关产业的发展，因为黄萎病引起的棉花减产问题非常严重，给棉农及国家造成了很大的经济损失。棉花黄萎病已成为棉花生产可持续发展的主要障碍之一，被称为“棉花的癌症”(简桂良等.2003),并已成为当前制约棉花生产的突出问题。

2、棉花黄萎病是由土壤丝状真菌大丽轮枝菌(verticillium dahliae kleb.)所引起的，是一种土壤传播的维管束病害,而且病原菌变异较快，具有分布广，危害重，存活时间长，化学农药难于防治等特点，是棉花生长过程中最具毁灭性的病害之一。

3、传统的作物抗病技术包括抗病品种的培育和施用农药等手段，虽然棉花常规育种在获得抗病、农艺性状优良新品种方面已取得了很大成就，大大促进了棉花生产，但由于育种周期长，又难以找到高抗病性的棉花原始种质，所以仅依靠常规育种很难适应目前棉花生产对抗病性的要求。

4、近年来基因工程的快速发展使得使用生物控制各种病害虫的方法变得可行，利用转基因技术培育抗性的农作物新品种，是现代农业生产利用高科技提高农作物产量、保护生态环境、促进农业可持续发展的关键技术之一，早已成为国际上不争的共识和各国重点攻关的方向。但是，目前我国致力于棉花黄萎病抗病性的研究主要还是单一的从宿主出发，进行分离鉴定棉花基因，离产业化育种生产还有很长的一段路。

5、近年来报道的抗棉花黄萎病的转基因植物主要有以下几种：在拟南芥中过量表达棉花非共生的血红蛋白基因ghhbd1能够诱导防卫反应并提高转基因植物的抗病性(qu,zhong et al.2006)；在棉花中表达杆状病毒抗凋亡基因p35和op-iap能够增强转基因棉花对大丽轮枝菌的抗性(tian,zhang et al.2010)；在海岛棉gossypium barbadense中克隆鉴定到一个抗大丽轮枝菌的基因gbve，该基因转入拟南芥中能使转基因拟南芥获得抗性(zhang,yang et al.2012)；在棉花中转入一个编码过敏致病性蛋白的基因hpaxoo能增强植物对大丽轮枝菌的防卫反应(miao,wang et al.2010)；在转基因棉花中表达植物的抗性蛋白nad1能增强对大丽轮枝菌及尖孢镰刀菌的抗性(gaspar,mckenna et al.2014)。除此以外，转几丁质酶基因或者一些抗性相关基因也有报道。这些研究都是在寄主棉花中寻找抗病基因，且大多停留在实验室小范围试验阶段，尚未进行大规模的田间试验。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种dna序列，其核苷酸序列如序列表seq id no.3所示。

2、进一步地，本发明提供了一种重组载体，含有权利要求1所述dna序列。

3、另外，本发明还提供了一种dna序列在棉花抗大丽轮枝菌中的应用。

4、第四方面，本发明提供了一种所述dna序列的制备方法，包括如下步骤：将在5’端加上bamhi酶切位点和3’端加上ecori酶切位点的seq id no.1所示序列与5’端加上bglii酶切位点和3’端加上saci酶切位点seq id no.2所示序列分别连接到载体puc57-amp上；将用bamhi和ecori酶切得到含seq id no.1所示序列的片段与用saci和bglii酶切得到含seqid no.2所示序列的片段连接到载体psk-int得载体psk-int-rnai；将载体psk-int-rnai用bamhi和saci酶切得如seq id no.3所示序列的基因。

5、第五方面，本发明提供了一种培育抗大丽轮枝菌的棉花的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述dna序列连接到pbi121载体中得agdpps-rnai表达载体；将agdpps-rnai表达载体用电击转化的方法导入农杆菌感受态细胞中得转化成功的农杆菌；将转化成功的农杆菌感染棉籽的下胚轴得抗大丽轮枝菌的棉籽。

6、本发明通过在棉花植株中导入三种大丽轮枝菌致病基因的序列，使棉花植株中转录生成与三种大丽轮枝菌致病基因相对应的双链rna结构，棉花植株中的dicer-like蛋白将双链rna切割成20-25nt大小的sirna，这些sirna可以识别侵染棉花的大丽轮枝菌当中与之序列互补的三种致病基因mrna并致其降解，降低大丽轮枝菌的致病性。比起只转入单个大丽轮枝菌致病基因的方法，此方法可以提高sirna的靶向范围，从而大大降低大丽轮枝菌的致病性。

技术特征：

1.一种dna序列，其特征在于，其核苷酸序列如序列表seq id no.3所示。

2.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1所述dna序列。

3.权利要求1所述dna序列在棉花抗大丽轮枝菌中的应用。

4.权利要求1所述dna序列的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.培育抗大丽轮枝菌的棉花的方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结本发明属于生物技术领域，具体涉及培育抗黄萎病的棉花的技术领域。本发明提供了一种DNA序列和培育抗大丽轮枝菌的棉花的方法，所述DNA序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，所述培育抗大丽轮枝菌的棉花的方法，包括如下步骤：将序列表SEQ ID NO.3所示DNA序列连接到pBI121载体中得AgDPPS‑RNAi表达载体；将AgDPPS‑RNAi表达载体用电击转化的方法导入农杆菌感受态细胞中得转化成功的农杆菌；将转化成功的农杆菌感染棉籽的下胚轴得抗大丽轮枝菌的棉籽。本发明方法培育的棉花能够对大丽轮枝菌产生抗性。技术研发人员：郭惠珊,张涛,赵建华受保护的技术使用者：中国科学院微生物研究所技术研发日：技术公布日：2024/6/18