一种富集胎儿游离DNA的血浆核酸提取方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种富集胎儿游离dna的血浆核酸提取方法，可根据下游检测需求选择性地提高所得游离dna提取产物中胎儿来源游离dna的占比。

背景技术：

1、无创产前dna检测技术(no-vasiveprenataltesting，nipt)是一种基于孕妇外周血血浆中胎儿来源游离dna(cffdna)的新型产前筛查技术。主要筛查疾病包括唐氏综合征(t21)、爱德华氏综合征(t18)、帕陶氏综合征(t13)、性染色体非整倍体及部分染色体拷贝数变异。该技术通过采集孕妇静脉血，分离血浆并提取血浆中的游离dna(即cfdna)制备测序文库，借助于高通量基因测序方法进行深度测序，同时结合生物信息学分析技术，评估胎儿患染色体异常疾病的风险。目前，无创产前基因检测已经在临床上广泛应用，降低了孕妇因过度的侵入性产前诊断而导致的流产风险，同时提高了胎儿染色体非整倍体疾病的检出率，降低了检测的假阳性率。此外，nipt还应用于单基因遗传病检测，可直接检测胎儿是否携带致病基因；同时，还可以应用在染色体微缺失/微重复检测方面。染色体微缺失/微重复是除染色体非整倍体之外的另一大引起新生儿出生缺陷的遗传性因素，是一类由于染色体拷贝数变异(copynumbervariation,cnv)而导致的具有复杂临床表型的综合征性疾病。研究表明，在高测序深度、高胎儿游离dna浓度的情况下，nipt可用于检测胎儿染色体微缺失重复检测。

2、由此可知nipt在染色体非整倍体疾病、单基因遗传病检测、染色体微缺失/微重复检测等方面，其最终检测靶标都是孕妇外周血血浆中全部游离dna中的胎儿游离dna(即cffdna)部分，其检测的准确性会受到孕妇外周血血浆中全部游离dna中胎儿游离dna占比的影响。通常情况下，孕妇外周血游离dna中胎儿游离dna占比非常低，这种占比对nipt等后续检测策略构成相当大的挑战，再加上不同母体个体间差异、实验操作误差以及样本质量等因素的影响，检测样本中胎儿游离dna的含量极大地影响了相关检测的效率和准确性。提高胎儿游离dna在待检样本中的占比，即提高待检样本中靶标胎儿游离dna的浓度，可有效降低母源性游离dna带来的背景噪音数据，提高检测结果的准确性，降低假阴性发生概率。同时，提高待检样本中胎儿游离dna的浓度还可以减小后续建库试剂体系和高通量测序所需数据量，有利于降低检测成本。因此，有必要开发一种稳定而高效地富集胎儿游离dna的血浆核酸提取方法，可根据下游检测需求选择性地提高所得游离dna提取产物中胎儿游离dna的占比。

技术实现思路

1、需要说明的是，本发明是基于发明人的下列研究和发现才完成的：

2、本发明发现，孕妇外周血血浆中婴儿来源游离dna部分片段大小与母源游离dna片段大小存在差异，其全部游离dna片段大小峰值约为166bp，而胎儿游离dna片段则较小，约为143bp。基于这一发现，可实现通过使用对不同片段大小的dna具有不同回收效率的片段筛选方案有针对性地实现富集孕妇血浆全部游离dna中150bp以下的小片段部分，去除大片段部分(根据检测目标的不同，所述的大片段与小片段的区分阈值n取值不同)，从而提高胎儿游离dna在全部游离dna中的占比。由此也可见，胎儿游离dna的富集过程中核心环节应当为大片段去除(或小片段富集)步骤。该步骤的高回收精度、稳定的大片段的去除(或小片段富集)能力可在很大程度稳定而有效地提高下游产出待检样本中胎儿游离dna的浓度。

3、本发明发现，在使用现有的dna片段筛选方案(包括但不限于二氧化硅吸附/洗脱、凝胶电泳、固相可逆吸附等)来富集胎儿游离dna，均存在富集效果的稳定性差以及富集后游离dna的回收效率不足的问题。在一具体实施例中，首先使用高结合力羟基磁珠提取孕妇血浆样本，获得全部游离dna溶液。然后，使用高效的片段筛选纯化试剂富集所得全部游离dna溶液以获得富集胎儿游离dna的提取产物。但该方案针对相同样本的平行实验结果，呈现出显著的不稳定性，说明该方案存在富集稳定性差的问题。分析发现其中采用将固定体积的游离dna溶液与一定比例的固定体积羧基磁珠核酸纯化试剂混合，达到对不同片段具有不同纯化效率的反应体系，结合大片段dna与羧基磁珠上，保留小片段dna于溶液中。但这一过程对于片段大小的回收效率差异精确依赖dna溶液与磁珠溶液混合后的体系中的有效分子浓度有关(包括但不限于peg浓度，盐离子浓度等)，这一有效分子浓度取决于最终反应溶液中的自由水含量以及大分子peg含量、阳离子含量的比例。因此如果想要达到高精度高稳定性的大片段去除效果，就高度依赖两个因素：1)液体混合过程中的取样体积的精度和稳定；2)提取产物dna溶液中的自由水含量。但在实际操作中，这两因素会受液相残留(例如：乙醇、洗涤液等)、液体间混合体积变化、吸取移液操作的精确性和稳定性等的影响。例如：1)液体混合体积的准确性及精密度的问题。在实际实验操作中，实验过程会因移液器具自身的精度以及操作的波动性，具有不可避免的随机误差以及可能的人为失误。导致大片段去除步骤反应液浓度在传统流程下的固有精度受到限制，无法消除操作带来的误差，进而不能保证筛选效果及筛选效果稳定性。2)在提取实验过程中，提取产物游离dna溶液在进行最后的洗脱步骤前需要高浓度醇溶液漂洗去除多余的杂质及离子，并在洗脱前将漂洗也去除。但是因为移液系统无法精密全部去除容器内溶液，一般会采用晾干的方式以最终去除。但这一过程在实际操作过程中，会因为液体去除操作的不完全，或晾干过程的不充分(晾干不充分在核酸提取中是常见的，因为过度的晾干操作会导致磁珠板结，影响后续核酸洗脱效果)，导致提取产物核酸溶液中总会或多或少的残留不同程度的漂洗液。这部分漂洗液的存在，会使得大片段去除步骤选取固定体积溶液混合时，其中真正的自有水含量比例存在不确定性，导致大片段去除步骤体系浓度(水基质溶液)产生误差，不能保证筛选效果及筛选效果稳定性。

4、本发明发现，在游离dna洗脱过程中，容器吸附、磁珠浸入等原因不可避免地导致部分游离dna溶液形成无法被移液器吸取的死体积，无法进入后续片段筛选过程，进而造成的游离dna损失。此问题可以通过增大洗脱体积的方式来降低死体积占比，但大片段去除步骤中混合后筛选体系所需的倍数于待筛选核酸液相(即游离dna提取过程中的洗脱体系)的混合比例，使得下游体系限制了游离dna提取过程中的洗脱体系的体积上限，继而限制了核酸片段富集回收率。

5、为解决上述问题，本发明提供一种富集胎儿游离dna的血浆核酸提取方法，简并了孕妇血浆游离dna提取流程与胎儿游离dna筛选富集流程，构建了一套双核分步式连续反应方案，以孕妇血浆为样本起始，实现稳定高效的获得胎儿游离dna占比提升的游离dna提取产物，并且该方法可根据下游检测需求通过调整核心试剂的比例，选择性地调整(提高)提取产物胎儿游离dna的富集浓度(即胎儿游离dna占比)，满足不同检测需求。

6、因此，在一方面本发明提供一种富集胎儿游离dna的血浆核酸提取方法，其包括：全部游离dna回收和大片段游离dna去除。

7、其中，全部游离dna回收，是通过在盐离子酸性溶液体系下，使游离dna与羟基结合部结合，获得结合有游离dna片段的羟基结合部的固相部分和包含其余成分的液相部分；分离并除去液相部分，获得结合有游离dna片段的羟基结合部的固相部分；

8、其中，大片段游离dna去除，通过在碱性条件下使含有羧基结合部的液相与结合有游离dna片段的羟基结合部的固相部分进行混合孵育，获得包含有与羧基结合部相结合的游离dna片段的固相部分和包含未与羧基结合部和/或羟基结合部结合的游离dna片段的液相部分；分离固相和液相，获得包含待富集胎儿来源游离dna片段的液相部分；

9、在一些实施方式中，羟基结合部包括带有羟基修饰基团的核酸结合载体；

10、在一些实施方式中，羧基结合部包括带有羧基修饰基团的核酸结合载体。

11、在一些实施方式中，羧基结合部具有游离dna片段筛选能力，可同时洗脱羟基结合部上结合的游离dna片段，并选择性地结合其中目标片段大小的游离dna片段。

12、在一些实施方式中，盐离子酸性溶液体系通过向体系中加入裂解液实现。

13、在一些实施方式中，裂解结合液含有离液盐。例如，离液盐，包括碘化钠、高氯酸钠、盐酸胍、异硫氰酸胍中的任一种或多种。

14、在一些实施方式中，裂解结合液还含有表面活性剂、tris、edta。

15、在一些实施方式中，面活性剂为非离子型表面活性剂。

16、例如，表面活性剂为tween20、triton-x100、sds、np40和聚氧乙烯中的一种或多种。

17、在一些实施方式中，tris为tris-hcl和tris-ac中的任一种或两种。

18、在一些实施方式中，裂解结合液含有4～6m异硫氰酸胍，0.5～2m盐酸胍，1～4重量％triton x-100,50～100mm tris-hcl,ph5～6,5～10mm edta。

19、在一些实施方式中，羟基结合部选自羟基磁珠、硅醇基磁珠、羟基玻璃珠、带有羟基玻璃纤维膜、带羟基硅胶模、微孔玻璃、嵌入二氧化硅颗粒滤膜、硅胶颗粒、二氧化硅构成的藻土型树脂、玻璃纤维中的任一种或多种。

20、例如，所述羟基结合部选自羟基磁珠、硅醇基磁珠、羟基玻璃珠、带有羟基玻璃纤维膜中的任一种或多种。

21、例如，所述羟基结合部为羟基磁珠；

22、例如，所述羟基磁珠为羟基磁珠悬浮液，其包含30～80mg/ml羟基修饰磁珠。

23、例如，所述羟基磁珠悬浮液，其包括40mg/ml羟基修饰磁珠。

24、在一些实施方式中，所述羧基结合部选自羧基磁珠、羧基玻璃珠、羧基玻璃纤维膜、羧基颗粒中的任一种或多种。

25、例如，所述羧基结合部选自羧基磁珠、羧基玻璃珠中的任一种或两种。

26、例如，所述羧基结合部为羧基磁珠。

27、在一些实施方式中，所述羧基磁珠为含有peg和盐离子的碱性羧基磁珠悬浮液。

28、所述羧基磁珠悬浮液，其组成选自可实现目标胎儿游离dna富集浓度提升的任一组合。

29、例如，所述peg选自peg6000～20000任一种或多种。

30、例如，所述羧基磁珠悬浮液，其组成包括0.05～2重量％的羧基修饰磁珠，10～20重量％的peg6000～20000，1～4m的nacl，1-100mm的tris-hcl，以及0.1-10mm的edta，ph值为6.0～9.0。

31、例如，所述羧基磁珠悬浮液，其组成包括1重量％的羧基修饰磁珠，14重量％的peg10000，1.5m的nacl，20mm的tris-hcl，以及1.5mm的edta，ph值为8.0。

32、在一些实施方式中，所述大片段游离dna是指除片段长度大于n的游离dna片段。例如，n大小为50bp～300bp中的任一长度。

33、例如，所述n大小为50～250bp中的任一长度。

34、例如，所述n大小为100-200bp中的任一长度。

35、例如，所述n大小为150bp。

36、在一些实施方式中，大片段游离dna去除步骤后还包括小片段游离dna回收和洗脱。

37、其中，所述小片段游离dna回收是通过将大片段游离dna去除步骤中获得包含待富集胎儿来源游离dna片段的液相部分与第二羧基结合部进行混合孵育，获得包含有与第二羧基结合部相结合的游离dna片段的固相部分和包含其余成分的液相部分；分离固相和液相，获得与第二羧基结合部相结合的游离dna片段的固相部分。

38、在一些实施方式中，所述洗脱，是通过低盐溶液洗脱第二羧基结合部上结合的游离dna片段，洗脱溶液即为胎儿来源游离dna占比提升的游离dna富集提取产物。

39、在一些实施方式中，所述第二羧基结合部包括带有羧基修饰基团的核酸结合载体。

40、在一些实施方式中，所述洗脱步骤前还包括洗涤步骤，其可去除残留在与第二羧基结合部相结合的游离dna片段的固相上的peg和盐溶液。

41、例如，所述洗涤步骤使用70％～80％乙醇溶液。

42、在一些实施方式中，所述第二羧基结合部选自羧基磁珠、羧基玻璃珠、羧基玻璃纤维膜、羧基颗粒中的任一种或多种。

43、例如，所述第二羧基结合部选自羧基磁珠、羧基玻璃珠中的任一种或两种。

44、例如，所述第二羧基结合部为羧基磁珠。

45、例如，所述羧基磁珠为含有peg和盐离子的碱性第二羧基磁珠悬浮液，所述第二羧基磁珠悬浮液中的peg和盐离子浓度大于羧基磁珠悬浮液。

46、例如，所述peg选自peg6000～20000。

47、例如，所述第二羧基磁珠悬浮液，其组成包括0.05～2重量％的羧基修饰磁珠，15～30重量％的peg6000～20000，1～4m的nacl，1-100mm的tris-hcl，以及0.1-10mm的edta，ph值为6.0～9.0。

48、例如，所述第二羧基磁珠悬浮液，其组成包括1重量％的羧基修饰磁珠，25重量％的peg10000，2.5m的nacl，20mm的tris-hcl，以及1.5mm的edta，ph值为8.0。

49、在一些实施方式中，所述全部游离dna回收步骤前还包括游离dna的释放步骤，其通过将孕妇血浆样本进行消化裂解，释放游离dna进入到消化液中。

50、例如，所述游离dna的释放进一步包括将孕妇血浆样本，与含有蛋白酶k和sds的体系进行混合孵育；

51、例如，所述混合孵育为37℃下的恒温孵育。

52、在一些实施方式中，所述全部游离dna回收和大片段去除步骤间还包括洗涤步骤，其可去除结合有游离dna片段的羟基结合部的固相部分上残留的蛋白和盐离子；

53、例如，所述洗涤步骤先后使用洗涤液ⅰ、洗涤液ⅱ，清洗结合有游离dna片段的羟基结合部的固相部分。

54、在一些实施方式中，所述核酸结合载体包括但不限于磁珠、玻璃珠、玻璃纤维、硅胶颗粒、硅胶膜、二氧化硅颗粒中的任一种或多种。

55、例如，所述核酸结合载体为磁珠，其为通用的磁性纳米颗粒。

56、例如，所述磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒。

57、在另一方面本发明提供一种构建dna测序文库的方法，其利用前述任一项所述的方法对dna样本进行富集处理；将富集处理产物进行dna建库处理，以便获得dna测序文库。

58、在另一方面本发明提供前述任一项所述的方法在富集血浆dna方面的应用。

59、例如，所述血浆dna包括胎儿游离dna、循环肿瘤dna、病原微生物dna中的任一种或多种。

60、在另一方面本发明提供前述任一项所述的方法在检测包括遗传异常、染色体畸变、染色体非整倍性、与癌症或肿瘤状态相关的生物标志物、与传染原有关的核酸中的任一项或多项中的应用。

61、本发明提供一种富集胎儿游离dna的血浆核酸提取方法，可根据下游检测需求选择性地提高所得游离dna提取产物中胎儿游离dna的占比。克服了液体混合体积的准确性及精密度的影响和提取产物游离dna溶液中的自由水含量的对富集稳定性的影响，提升了胎儿游离dna富集效果的精度和稳定性。并且通过简并的提取与筛选富集流程克服了提取过程中游离dna溶液体积损失提升了胎儿游离dna富集提取产量。同时，本发明可根据下游检测需求通过调整核心试剂的比例，选择性地调整提取产物胎儿游离dna的富集浓度(即胎儿游离dna占比)，满足更多检测需求。