基于不同光照下莱茵衣藻的蛋白相互作用分析方法

本发明属于分子生物学，涉及一种基于不同光照下莱茵衣藻的蛋白相互作用分析方法。

背景技术：

1、莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii，cr)属于绿藻口，团藻目，衣藻科，是真核单细胞生物；细胞直径10μm左右，含有一个大型杯状叶绿体，约占细胞体积的60％，包围着细胞核，有两根鞭毛位于细胞顶部，靠近细胞侧面有一个具有感光作用的眼点。莱茵衣藻生长条件简单，在实验室条件下就可以大量繁殖。莱茵衣藻具有培养条件简单、生长周期短、光效率高、遗传背景清楚等特点，且具有许多与酵母相似的特性，因此被誉为“光合酵母”。

2、sh ble基因为博来霉素的抗性基因，在莱茵衣藻中可以作为选择性标记。在莱茵衣藻中，ble蛋白通过进入细胞核结合抗生素来保护细胞，因此其表达量与抗生素的耐受程度成正比。

3、植物向光素的蛋白质结构可以分为两个片段：n端的感光结构域和c端的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。向光素的n末端感光结构域包含两个非常相似的结构域，约110个氨基酸，分别命名为lov1和lov2。lov结构域是与辅因子结合和介导蛋白相互作用相关的pas结构域家族成员，其由外部信号如光(light)，氧(oxygen)或电压(voltage)调节，因此缩写为lov。lov结构域结合辅因子黄素单核苷酸(fmn)作为蛋白质蓝光传感器。fmn在蓝光照射下与丝氨酸残基结合并引发结构域的构象变化，当被置于黑暗中，lov结构域将通过一系列的构象变化回到初始状态。在高等植物中，趋光素通常负责感受环境光线中蓝光的强度。被激发后，lov结构域构象变化，从而激活羧基端的蛋白激酶，然后通过激酶修饰下游蛋白从而完成信号传导过程。

4、中国专利申请2021114055616公开了一种基于莱茵衣藻的蛋白相互作用方法，通过构建抗性基因sh ble和目标蛋白融合表达载体，将其转入衣藻中，在1:1红蓝光光照条件下培养纯化，最终得到目标蛋白及其相互作用蛋白。在这种情况下，虽然sh ble属于外源基因，理论上纯化出的其他蛋白基本上是与目标蛋白发生相互作用的蛋白，但是并没有对照实验证明理论结果。因此该方法，对于莱茵衣藻内是否存在于sh ble相互作用蛋白还无法确定。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于不同光照下莱茵衣藻的蛋白相互作用分析方法。

2、实现本发明目的的技术方案如下：

3、基于不同光照下莱茵衣藻的蛋白相互作用分析方法，具体步骤如下：

4、将含有向光性目标蛋白和抗性基因sh ble的质粒在莱茵衣藻中融合表达，利用博来霉素筛选出阳性克隆株，然后将阳性克隆株接种到tap培养基，待菌液生长至od600为0.6，将菌液以1:50的比例二次接种到tap培养基中，并在不同光照下大规模培养，所述的光照条件为1:1的25％红光和25％蓝光构成的红蓝光、25％红光、25％蓝光或黑暗条件，最后利用strepⅱtag亲和柱同时纯化向光性目标蛋白以及与向光性目标蛋白发生相互作用的相关蛋白。

5、具体地，含有向光性目标蛋白和抗性基因sh ble的质粒在莱茵衣藻中融合表达的方法为：先构建抗性基因sh ble与含有向光性目标蛋白的融合表达载体，再对融合表达载体酶切线性化，最后将线性化dna转入莱茵衣藻中。

6、本发明所述的向光性目标蛋白可以是任何向光性蛋白，如光敏色素(phy)、隐色素(cry)、向光素(phot)等。在本发明具体实施方式中，采用的莱茵衣藻蛋白为向光素蛋白(phot)的lov1结构域，采用的含有向光性目标蛋白和抗性基因sh ble的质粒为pcyx0010。

7、本发明所述的莱茵衣藻为博来霉素敏感的莱茵衣藻菌种，包括但不限于细胞壁缺陷型过表达诱变株uvm11。

8、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

9、针对在莱茵衣藻体内难于表达外源性重组基因的难题，本发明利用将抗性基因shble与目标蛋白融合表达，利用strep ii tag的高特异性纯化出与目标蛋白相互作用的相关蛋白，实现对目标蛋白相互作用的鉴定。本发明方法不需要额外的筛选标记，大大降低了转化株筛选工作量。同时，由于lov1是蓝光受体蛋白，不同光照可以形成自身对照，不需要额外的对照实验。本发明方法可以扩展到几乎所有莱茵衣藻光致蛋白信号传递通路的分析检测。

技术特征：

1.基于不同光照下莱茵衣藻的蛋白相互作用分析方法，其特征在于，具体步骤如下：

2.根据权利要求1所述的蛋白相互作用分析方法，其特征在于，含有向光性目标蛋白和抗性基因sh ble的质粒在莱茵衣藻中融合表达的方法为：先构建抗性基因sh ble与含有向光性目标蛋白的融合表达载体，再对融合表达载体酶切线性化，最后将线性化dna转入莱茵衣藻中。

3.根据权利要求1所述的蛋白相互作用分析方法，其特征在于，向光性目标蛋白为光敏色素、隐色素或向光素。

4.根据权利要求1所述的蛋白相互作用分析方法，其特征在于，向光性目标蛋白为向光素蛋白的lov1结构域。

5.根据权利要求1所述的蛋白相互作用分析方法，其特征在于，采用的含有向光性目标蛋白和抗性基因sh ble的质粒为pcyx0010。

6.根据权利要求1所述的蛋白相互作用分析方法，其特征在于，莱茵衣藻为博来霉素敏感的莱茵衣藻菌种。

7.根据权利要求1所述的蛋白相互作用分析方法，其特征在于，莱茵衣藻为细胞壁缺陷型过表达诱变株uvm11。

技术总结本发明公开了一种基于不同光照下莱茵衣藻的蛋白相互作用分析方法。所述方法将含有向光性目标蛋白和抗性基因Sh Ble的质粒在莱茵衣藻中融合表达，利用博来霉素筛选出阳性克隆株，然后将阳性克隆株在不同光照下大规模培养，最后利用StrepⅡTag亲和柱同时纯化向光性目标蛋白以及与向光性目标蛋白发生相互作用的相关蛋白。本发明方法不需要额外的筛选标记，大大降低了转化株筛选工作量。本发明方法可以扩展到几乎所有莱茵衣藻光致蛋白信号传递通路的分析检测。技术研发人员：朱昱诺,周敏受保护的技术使用者：南京理工大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18