基于CRISPR/Cas13a系统的一步法无靶标扩增可视化RNA病毒检测方法

本发明属于分子诊断和生化分析方法研究领域，具体涉及一种基于crispr/cas13a系统的一步法无靶标扩增可视化rna病毒检测方法。

背景技术：

1、快速准确地诊断疾病是有效治疗和长期预防后遗症的关键。与疾病相关的以核酸为基础的生物标记物对疾病诊断至关重要。rna分子作为重要的遗传信息载体，由于它们在基础生物化学研究到临床诊断的各个领域等众多生物过程中的重要作用，rna分子的特异性和灵敏检测变得越来越重要。事实上，以核酸为基础的诊断方法已经成为治疗各种急性和慢性疾病，特别是感染性疾病的金标准。

2、常用的rna分析检测方法有以下几种，主要分为直接检测和基于核酸扩增的检测。northern印迹，荧光原位杂交(fish)，dna微阵列等直接检测方法特异性较高，但实验繁琐耗时且灵敏度不足。基于核酸扩增的rna检测方法，包括逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)以及多种等温核酸扩增技术大大提高了灵敏度，但其方法的可操作性受限于复杂的探针设计，扩增偏差等问题。

3、近年来，得益于cas12、cas13和cas14在识别和切割特定靶标后表现出强大的反式切割活性的特点，揭示出crispr系统在核酸检测中的巨大潜力。即可以基于crispr相关(cas)蛋白识别目标序列，同时激活cas蛋白的反式切割，裂解dna或rna荧光报告基因，实现荧光可视化检测。进一步地，研究人员还进一步探索出了将cas13a反式切割活性的附带效应与重组酶聚合酶扩增(rpa)的等温扩增相结合的多种基于crispr的诊断方法，实现了具有单分子灵敏度和单碱基错配特异性的快速dna或rna检测，比如sherlock和detectr。尽管这些方法已被开发应用于多种rna病毒的即时检测，但其所必须的靶标扩增步骤往往会引入一些比较棘手的问题，例如由于逆转录不完全导致的目标rna分子丢失、易错序列复制导致的扩增偏差以及污染导致的假阳性结果。因此，开发更简便、灵敏、安全的无靶标扩增的rna病毒定量检测方法，对于传染性疾病的筛查和控制是必不可少的。

4、滚环扩增(rca)是一种简单高效的等温酶促过程，可以利用独特的dna聚合酶生成长单链dna。得益于其高度信号扩增能力，rca被广泛地用于开发dna、rna、dna甲基化、单核苷酸多态性(snp)、蛋白和细胞的灵敏检测方法。因此，rca反应可作为cas13a报告信号的进一步放大器以实现无靶标扩增的rna病毒超灵敏定量检测。申请号为202111191999.9的中国专利申请即结合了rca和crispr-cas12a得到了一种无非特异滚环扩增的可视化检测系统，但其仍存在如下不足：(1)需要多步酶反应；(2)反应组分复杂；(3)检测时间长；(4)多步操作过程易发生污染引起假阳性及生物安全问题；(5)检测限不足。

5、因此，为进一步改进上述技术，开发一种反应组分、步骤精简，检测快速、准确、灵敏度更高的无靶标扩增定量检测rna病毒检测方法，具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于crispr/cas13a系统的一步法无靶标扩增的可视化rna病毒检测方法。

2、本发明提供了一种拓扑杂交的dna/rna双环，它由一条环状dna与一条环状rna通过碱基互补配对结合而成；

3、所述环状rna的序列如seq id no.1所示；所述环状dna的序列如seq id no.2所示。

4、本发明还提供了上述的dna/rna双环在制备病毒rna检测试剂盒中的用途。

5、本发明还提供了一种检测rna病毒的试剂盒，包括上述的dna/rna双环。

6、进一步地，上述的试剂盒还包括荧光分子；所述荧光分子的序列如seq id no.4所示，且修饰有荧光基团。

7、更进一步地，上述荧光基团选自：cy3、cy5或fam，优选为cy3。

8、进一步地，上述的试剂盒还包括cas13a蛋白和crrna，所述crrna能够特异性识别病毒的rna。

9、更进一步地，上述病毒是h2n3病毒，所述crrna的序列如seq id no.3所示。

10、进一步地，上述的试剂盒还包括rca反应试剂；优选地，所述rca反应试剂包括t4pnk、phi29 dna聚合酶。

11、本发明还提供了一种检测rna病毒的方法，包括使用上述的试剂盒进行检测的步骤；优选地，包括如下步骤：

12、(1)将所述试剂盒中的各组分在缓冲液中混匀制备得到检测体系；

13、(2)向检测体系中加入病毒rna待测样品，混匀并反应；

14、(3)检测荧光信号。

15、本发明还提供了一种定量检测rna病毒的方法，包括通过上述检测rna病毒的方法检测荧光信号后，对荧光信号点进行计数分析的步骤。

16、本发明的有益效果：本发明试剂盒基于crispr/cas13a系统结合rca技术进行rna病毒检测，一方面利用了cas13a的反式切割活性，另一方面利用本发明特定的拓扑杂交的dna/rna双环作为cas13a的报告及信号放大体系，不需要靶标rna预扩增步骤，且能够实现高信噪比的靶标灵敏检测。通过对改造对crrna的靶标rna识别区域，可适用于多种rna病毒，mirna，circrna等疾病生物标志物的定量检测。

17、并且，利用本发明试剂盒进行检测方法，在室温条件下，全部过程只需在一个试管中进行一次均相混合反应，省去了分离和控温过程，检测过程方便快捷，具有很好的推广应用前景。

18、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

19、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

技术特征：

1.一种拓扑杂交的dna/rna双环，其特征在于，它由一条环状dna与一条环状rna通过碱基互补配对结合而成；

2.权利要求1所述的dna/rna双环在制备病毒rna检测试剂盒中的用途。

3.一种检测rna病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的dna/rna双环。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光分子；所述荧光分子的序列如seq id no.4所示，且修饰有荧光基团。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自：cy3、cy5或fam，优选为cy3。

6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括cas13a蛋白和crrna，所述crrna能够特异性识别病毒的rna。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述病毒是h2n3病毒，所述crrna的序列如seq id no.3所示。

8.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括rca反应试剂；优选地，所述rca反应试剂包括t4 pnk、phi29 dna聚合酶。

9.一种检测rna病毒的方法，其特征在于，包括使用权利要求2～8任一项所述的试剂盒进行检测的步骤；优选地，包括如下步骤：

10.一种定量检测rna病毒的方法，其特征在于，包括通过权利要求9所述的方法检测荧光信号后，对荧光信号点进行计数分析的步骤。

技术总结本发明提供了一种基于CRISPR/Cas13a系统的一步法无靶标扩增可视化RNA病毒检测方法。具体提供了一种拓扑杂交的DNA/RNA双环，以及利用该DNA/RNA双环可实现的RCA技术与CRISPR/Cas13a系统结合，进行RNA病毒检测的试剂盒。本发明不需要靶标RNA预扩增步骤，操作步骤简单快速，能够实现高信噪比的靶标灵敏检测，具有很好的推广应用前景。技术研发人员：张开翔,李亚楠,裴怡然,徐汝,高华,史进进,张振中受保护的技术使用者：郑州大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18