一种抑制SCN9A基因表达的siRNA、其药物组合物及用途的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种抑制scn9a基因表达的sirna、其药物组合物及用途。

背景技术：

1、疼痛的产生起源于广泛分布全身的神经末梢将感受到的机械、化学或热刺激转化为神经冲动(动物电位)并经传入神经纤维传递至背根神经节，最终传递至高级神经中枢，从而引起痛觉。动作电位的产生和传导依赖于细胞膜上的电压门控钠通道(nav.s)的激活与失活。电压门控钠通道是一类跨膜糖蛋白，由一个α亚基和数个β亚基构成，目前已在哺乳动物中鉴定出9种亚型nav1.1～nav1.9。目前普遍认为(dib-hajj sd等人，annu revneurosci.2010；33:325-47)nav1.3、nav1.7、nav1.8和nav1.9与疼痛有关，其中na(v)1.7具有特殊意义，它与一系列遗传性人类疼痛障碍有关。

2、电压门控钠通道nav1.7，编码基因为scn9a，主要表达在drg神经元、交感神经元、神经内分泌细胞中。目前发现遗传性红斑肢痛(iem)(yang y等人，journal of medicalgenetics,2004,41(3):171-174；dib-hajj sd等人，brain:a journal of neurology,2005,128(8):1847-1854；drenth j p等人，the journal of investigativedermatology,2005,124(6):1333-1338)、阵发性极度疼痛障碍(pepd)(fertleman cr等人，neuron,2006,52(5):767-774；dib-hajj sd等人，molecular pain,2008,4:37)、先天性痛觉缺失(cip)(cox jj等人，nature,2006,444(7121):894-898；goldberg y p等人，clinical genetics,2007,71(4):311-319)均与nav1.7的功能突变有关。此外，动物实验表明炎症会引发drg神经元中nav1.7的表达上升(black ja等人，pain,2004,108(3):237-247)，在sni模型中scn9a mrna表达升高(shaojp等人，molecular pain；volume 12:1–13)。目前临床报道已有许多识别nav 1.7的小分子药物，但nav1家族氨基酸同源性高，寻找具有良好特异性和pk/pd的药物似乎一直具有挑战性。

3、目前在疼痛治疗领域中，从药物种类分析，阿片类止痛药和非甾体抗炎药(nsaid)在止痛药中占据主流地位，但非甾体抗炎药引发包括胃肠道出血、心肌梗塞和中风的多种副作用。不适用于患有心血管类疾病、糖尿病等人群，阿片类止痛药普遍存在安全性和成瘾性问题，人们对止痛的需求却与日俱增。

4、综上所述，现有技术中存在的药物具有较多缺陷，主要包括：a)主流疼痛药物阿片类止痛药和非甾体抗炎药，副作用多；b)针对疼痛靶点nav1.7尚无上市药物，同靶点临床阶段的药物多为小分子药，且由于钠离子通道(nav1.1-1.9)的几种蛋白有较高的氨基酸序列同源性，小分子药物难以实现nav1.7的特异选择性抑制，且易导致严重的毒副作用；c)在核酸领域，临床阶段仅olipass一款肽核酸药物，而肽核酸的有效分子寡核苷酸类(aso)在有效性和长效性表现上稍逊于sirna药物。

5、因此，目前需要一种能够有效且高特异性抑制人scn9a表达的药物。rna干扰(rnainterference，rnai)是序列特异性降解rna、在转录后调控基因表达水平的方法。目前rnai作为一种高效且能够序列特异性沉默或敲低基因的技术在多个治疗领域发展迅速。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种抑制scn9a基因mrna转录物的sirna、其缀合物和药物组合物，以用于诸如预防或治疗疼痛。

2、为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

3、本发明第一方面提供一种sirna，其包括正义链和反义链，所述sirna中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，所述正义链包括如下序列或与如下序列不超过3个碱基突变的核苷酸序列，所述反义链包括如下序列或与如下序列不超过5个碱基突变的核苷酸序列。

4、根据第一种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:15，所述反义链的序列如seq id no:16。

5、根据第二种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:7，所述反义链的序列如seq id no:8。

6、根据第三种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:9，所述反义链的序列如seq id no:10。

7、根据第四种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:1，所述反义链的序列如seq id no:2。

8、根据第五种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:3，所述反义链的序列如seq id no:4。

9、根据第六种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:5，所述反义链的序列如seq id no:6。

10、根据第七种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:11，所述反义链的序列如seq id no:12。

11、根据第八种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:13，所述反义链的序列如seq id no:14。

12、根据第九种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:17，所述反义链的序列如seq id no:18。

13、根据第十种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:19，所述反义链的序列如seq id no:20。

14、根据第十一种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:21，所述反义链的序列如seq id no:22。

15、根据第十二种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:23，所述反义链的序列如seq id no:24。

16、根据第十三种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:25，所述反义链的序列如seq id no:26。

17、根据第十四种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:27，所述反义链的序列如seq id no:28。

18、根据第十五种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:29，所述反义链的序列如seq id no:30。

19、根据第十六种实施方式，所述正义链的序列如seq id no:31，所述反义链的序列如seq id no:32。

20、根据某些实施方式，所述正义链包括与上述核苷酸序列中的任一条不超过2个碱基突变的核苷酸序列，不超过1个碱基突变的核苷酸序列。

21、根据某些实施方式，所述正义链的碱基突变可以在核苷酸序列的任意位置，例如第一位、第二位、第三位、第四位、第五位、第六位、第七位、第八位、第九位、第十位、第十一位、第十二位、第十三位、第十四位、第十五位、第十六位、第十七位、第十八位、第十九位中的任意一位、两位或三位。

22、根据某些实施方式，所述反义链包括与上述核苷酸序列中的任一条不超过5个碱基突变的核苷酸序列，不超过4个碱基突变的核苷酸序列，不超过3个碱基突变的核苷酸序列，不超过2个碱基突变的核苷酸序列，不超过1个碱基突变的核苷酸序列。

23、根据某些实施方式，所述反义链的碱基突变可以在核苷酸序列的任意位置，例如第一位、第二位、第三位、第四位、第五位、第六位、第七位、第八位、第九位、第十位、第十一位、第十二位、第十三位、第十四位、第十五位、第十六位、第十七位、第十八位、第十九位、第二十位、第二十一位中的任意一位、两位、三位、四位或五位。

24、根据某些实施方式，按照5’到3’的方向，所述正义链的碱基突变在其核苷酸序列的3’末端，所述反义链的碱基突变在其核苷酸序列的5’末端、第2～8位、3’端最后两位中的任意一位或多位。

25、根据某些实施方式，所示碱基突变包括碱基的替换、插入或者缺失。

26、在某些实施方案中，所述修饰的核苷酸为2’-甲氧基修饰的核苷酸、2’-氟代修饰的核苷酸、2’-o-ch2-ch2-o-ch3修饰的核苷酸、2’-o-ch2-ch＝ch2修饰的核苷酸、2’-ch2-ch2-ch＝ch2修饰的核苷酸、2’-脱氧基核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、硫代磷酸酯键修饰的核苷酸、vp修饰的核苷酸、lna、ena、cet bna、una、gna、safe-01或2’-o-十六烷基修饰的核苷酸中的一种或多种的组合，其中，safe-01所示结构式中的r1为h、oh或ch3，base为天然核碱基、修饰的核碱基、通用碱基或h原子。进一步地，r1为ch3。

27、在某些实施方案中，所述正义链中的修饰核苷酸的个数为一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个或十九个。

28、在某些实施方案中，所述反义链中的修饰核苷酸的个数为一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或二十一个。

29、在某些实施方案中，所述正义链和所述反义链中的全部的核苷酸为修饰的核苷酸。

30、在某些实施方案中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、7、8和9位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸。

31、在另一些实施方案中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、8和9位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸。

32、在上述两类实施方式中，进一步地，所述sirna中以下核苷酸之间的连接中至少一个为硫代磷酸酯基连接：

33、所述正义链的5’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；

34、所述正义链的5’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；

35、所述正义链的3’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；

36、所述正义链的3’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；

37、所述反义链的5’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；

38、所述反义链的5’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；

39、所述反义链的3’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；

40、所述反义链的3’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接。

41、再进一步地，按照5’到3’的方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：

42、所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；

43、所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；

44、所述正义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；

45、所述正义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；

46、或者，

47、所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：

48、所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；

49、所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。

50、再进一步地，按照5’到3’的方向，所述反义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：

51、所述反义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；

52、所述反义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；

53、所述反义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；

54、所述反义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。

55、在上述两类实施方式中，进一步地，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。

56、在上述两类实施方式中，进一步地，所述正义链和所述反义链的非氟代修饰的核苷酸为2’-甲氧基修饰的核苷酸。

57、在上述两类实施方式中，进一步地，按照5’到3’的方向，所述正义链的第6位的核苷酸为2’-o-十六烷基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端的磷酸基团被vp取代，所述正义链和所述反义链的其他位置的非氟代修饰的核苷酸为2’-甲氧基修饰的核苷酸。

58、在某些实施方案中，所述sirna选自表1或表2中的sirna。

59、本发明第二方面提供一种sirna缀合物，其包括上述sirna中的一条或多条，以及缀合至所述sirna的缀合基团。

60、本发明第三方面提供一种药物组合物，其包括上述sirna或上述sirna缀合物，以及药学上可接受的载体或辅料。

61、在某些实施方案中，所述药物组合物用于抑制scn9a基因表达。

62、本发明第四方面提供如上述sirna，或上述sirna缀合物，或上述药物组合物用于制备治疗和/或预防scn9a基因表达相关疾病的药剂的用途。

63、在某些实施方案中，所述疾病选自神经病性疼痛、感受伤害性疼痛、脏器相关疼痛和混合性疼痛。

64、进一步地，所述神经病性疼痛选自带状疱疹后神经痛、偏头痛和糖尿病性神经痛。

65、进一步地，所述感受伤害性疼痛选自骨质疏松症和类风湿性关节炎。

66、进一步地，所述脏器相关疼痛选自内脏相关疼痛和胰腺炎。

67、进一步地，所述混合性疼痛选自腰痛、癌痛和纤维肌痛。

68、在某些实施方案中，所述疾病选自遗传性红斑性肢痛症(eim)、阵发性极度疼痛障碍(pepd)、先天性痛觉缺失(cip)、慢性疼痛综合征和小纤维神经病。

69、本发明第五方面还提供一种抑制scn9a基因表达的方法，包括将治疗有效量的本发明的sirna，或本发明的sirna缀合物，或本发明的药物组合物与表达scn9a基因的细胞接触或给予有需要的受试者。

70、本发明还提供了一种治疗和/或预防scn9a基因表达相关的疾病的方法，包括将治疗有效量的本发明的sirna，或本发明的sirna缀合物，或本发明的药物组合物给予有需要的受试者。

71、本发明的sirna靶向scn9a基因，其主要表达在drg神经元、交感神经元、神经内分泌细胞中。本发明的sirna的活性高，可以实现远低于nm的活性，并且本发明的sirna对于nav1.7具有高度选择性序列，从根源上排除对其它钠离子通道的抑制导致的潜在毒副作用。此外，本发明的sirna药物的主要使用方法是神经节注射，通过选择神经节的位置，可直接作用于与痛觉传入有关的drg及脊髓中，由rna诱导的沉默复合物(risc)介导的对scn9a基因的rna转录物的切割，从而实现局部靶向器官或组织的scn9a的表达下调，且作用持久，从而减少给药频率，提高安全性，从而可以有效控制止痛的部位，并且防止对嗅觉和酸感等产生影响。神经细胞的细胞体，包括细胞核和核糖体等细胞器主要存在于神经节中。通过神经节注射，sirna药物可以有效的抑制nav1.7的蛋白质表达，可以同时降低外周神经和中枢神经中的nav1.7蛋白质。另外，通过配合合适的递送技术，例如cns递送技术，也可以通过鞘膜内注射实现中枢神经系统中的靶蛋白有效抑制。

72、由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

73、本发明提供的sirna、sirna缀合物和药物组合物在细胞实验和动物实验中显示出优异的scn9a基因表达抑制活性，具有良好的治疗scn9a基因表达相关的疾病的潜力。例如，本发明的sirna、sirna缀合物和药物组合物组织特异性好，安全性高；药效持续时间长，皮下给药，用药依从性高；与现有同类型的药物相比，药效和安全性都有很大的提升。