核酸扩增促进剂和使用其的检查方法与流程

本发明涉及核酸扩增促进剂和使用其的检查方法。

背景技术：

1、核酸扩增法是将目标核酸从数个拷贝扩增至数万倍以上的方法，在各种领域中用于基因的克隆、基因检查。

2、核酸扩增法的代表性方法是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction、pcr)法。典型的pcr法中，通过重复下述3个步骤来进行核酸的扩增：(1)模板dna的变性(从双链dna解离为单链dna)、(2)针对单链模板dna的引物的退火、(3)利用dna聚合酶的引物的延伸。

3、典型的pcr法原本是扩增dna的方法，但也可以应用于rna的扩增，这样的pcr法称为逆转录聚合酶链式反应法(以下有时简称为“rt-pcr法”)。rt-pcr法中，通过使用逆转录酶的酶反应而由rna合成互补dna(以下有时简称为“cdna”)，以该cdna为模板进行pcr，可以扩增rna。rt-pcr法进一步分为在不同容器中进行逆转录反应和pcr法的2步法、以及它们在同一容器内以一系列反应的方式进行的1步法。

4、基于通过pcr法得到的扩增产物的量来确定最初核酸的量的方法也是已知的，这样的pcr法称为定量聚合酶链式反应法(以下有时简称为“qpcr法”)。

5、进一步，还已知组合rt-pcr法和qpcr法而成的逆转录-定量pcr法(以下有时简称为“rt-qpcr法”)。

6、进而，近年来还开发了一种称为数字pcr法(以下有时简称为“dpcr法”)的方法，其应用微流路形成技术等，将反应液分配到数十～数万个极小区域一起进行pcr，根据扩增的区域的比例，使用统计模型，确定最初的核酸浓度。

7、除了如上所述的确定目标核酸的有无和/或量的目的之外，pcr法还用于确定目标核酸的碱基序列(测序)。测序pcr法有以sanger法为代表的各种方法，但大多以终点pcr法为基本原理。

8、此处，在利用核酸扩增法时，无论是扩增产物本身为目标物的情形、以最初的核酸量的定性或定量测定为目的的情形、还是以核酸的碱基序列的确定为目的的情形，提高扩增产物的浓度常常成为课题。因此，研究了各种促进pcr中的核酸扩增的技术。

9、例如，通过在pcr法的反应液中添加盐(例如，氯化钾、硫酸铵等)、甜菜碱、多元醇、聚乙二醇等来尝试促进核酸扩增的方式被广泛进行。但是，利用这些成分的添加的核酸扩增促进存在极限，需要更高的水平。

10、作为其它方法，已知有例如，添加单链dna结合蛋白质(ssb)来稳定双链dna的方法。此外，专利文献1中公开了作为用于促进dna的延伸反应的通用性高的dna复制促进因子(添加剂)的变异型pcna(增殖核抗原)单体。但是，由这些蛋白质组成的添加剂具有下述问题：难以大量生产、在保存稳定性上有问题，制造成本高。

11、现有技术文献

12、专利文献

13、专利文献1：国际公开第2007/004654号

技术实现思路

1、发明要解决的课题

2、本发明的目的在于提供与由蛋白质组成的添加剂相比，量产性和保存稳定性优异核酸扩增促进剂。

3、用于解决课题的手段

4、[1]核酸扩增促进剂，其由包含来自单体的构成单元的聚合物构成，该单体包含磷酰胆碱基。

5、[2]根据前述[1]所述的核酸扩增促进剂，其中，前述聚合物包含选自下述a组中的1种以上的聚合物：

6、[a组]

7、(a-1)仅包含来自2-(甲基)丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的构成单元的聚合物、

8、(a-2)包含来自2-(甲基)丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的构成单元和来自(甲基)丙烯酸的构成单元的共聚物、

9、(a-3)包含来自2-(甲基)丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的构成单元和来自c2～c20烷基(甲基)丙烯酸酯的构成单元的共聚物、

10、(a-4)包含来自2-(甲基)丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的构成单元、来自c2～c8烷基(甲基)丙烯酸酯的构成单元、和来自具有2个以上羟基作为取代基的c2～c8烷基(甲基)丙烯酸酯的构成单元的共聚物、以及

11、(a-5)包含来自2-(甲基)丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的构成单元和来自聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯的构成单元的共聚物。

12、[3]根据前述[2]所述的核酸扩增促进剂，其中，2-(甲基)丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱。

13、[4]根据前述[2]或[3]所述的核酸扩增促进剂，其中，(甲基)丙烯酸为甲基丙烯酸。

14、[5]根据前述[2]～[4]中任一项所述的核酸扩增促进剂，其中，c2～c20烷基(甲基)丙烯酸酯为(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸戊酯、(甲基)丙烯酸己酯、(甲基)丙烯酸庚酯、(甲基)丙烯酸辛酯、(甲基)丙烯酸壬酯、(甲基)丙烯酸癸酯、(甲基)丙烯酸十一烷基酯、(甲基)丙烯酸月桂酯、(甲基)丙烯酸十三烷基酯、(甲基)丙烯酸肉豆蔻酯、(甲基)丙烯酸十五烷基酯、(甲基)丙烯酸鲸蜡基酯、(甲基)丙烯酸十七烷基酯、(甲基)丙烯酸硬脂基酯、(甲基)丙烯酸十九烷基酯、或(甲基)丙烯酸二十烷基酯，优选为(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸戊酯、(甲基)丙烯酸月桂酯、(甲基)丙烯酸肉豆蔻酯、(甲基)丙烯酸鲸蜡基酯、或(甲基)丙烯酸硬脂基酯，更优选为(甲基)丙烯酸丁酯或(甲基)丙烯酸硬脂基酯，进一步优选为甲基丙烯酸丁酯或甲基丙烯酸硬脂基酯。

15、[6]根据前述[2]～[5]中任一项所述的核酸扩增促进剂，其中，c2～c8烷基(甲基)丙烯酸酯(具体为不含羟基的c2～c8烷基(甲基)丙烯酸酯)为(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸戊酯、(甲基)丙烯酸己酯、(甲基)丙烯酸庚酯、或(甲基)丙烯酸辛酯，优选为(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、或(甲基)丙烯酸戊酯，更优选为甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丁酯、或甲基丙烯酸戊酯，进一步优选为甲基丙烯酸丁酯。

16、[7]根据前述[2]～[6]中任一项所述的核酸扩增促进剂，其中，具有2个以上羟基作为取代基的c2～c8烷基(甲基)丙烯酸酯为甘油单(甲基)丙烯酸酯、苏糖醇单(甲基)丙烯酸酯、赤藓糖醇单(甲基)丙烯酸酯、木糖醇单(甲基)丙烯酸酯、阿拉伯糖醇单(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇单(甲基)丙烯酸酯、半乳糖醇单(甲基)丙烯酸酯、或山梨糖醇单(甲基)丙烯酸酯，优选为甘油单(甲基)丙烯酸酯或木糖醇单(甲基)丙烯酸酯，更优选为甘油单(甲基)丙烯酸酯，进一步优选为甘油单甲基丙烯酸酯。

17、[8]根据前述[2]～[7]中任一项所述的核酸扩增促进剂，其中，聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯为聚乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、或乙氧基聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯，优选为甲氧基聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、或乙氧基聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯，更优选为甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯或乙氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯，进一步优选为甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯。

18、[9]检查方法，其使用前述[1]～[8]中任一项所述的核酸扩增促进剂。

19、发明效果

20、本发明的核酸扩增促进剂可以增大核酸扩增法中得到的核酸扩增产物的量。因此，例如，为了改善使用核酸扩增法的目标核酸的收率、提高利用核酸扩增法的检查的性能、提高使用核酸扩增法的碱基序列确定的性能等，可以使用本发明的核酸扩增促进剂。此外，本发明的核酸扩增促进剂由于是合成聚合物，因此与由蛋白质构成的添加剂相比，量产性和保存稳定性优异。