一种类芽孢杆菌及其分离方法和应用与流程

本发明属于微生物发酵，具体涉及一种类芽孢杆菌。同时，本发明还涉及所述类芽孢杆菌的分离方法和应用。

背景技术：

1、微生物种类丰富，长期以来，人们利用纯培技术对环境中的微生物进行调查研究和开发利用。随着科学技术的发展，微生物资源在科技研究及生物产业中的重要性日益凸显。世界上许多国家都在搜集、保存各种微生物资源，其不断丰富将为生物技术的发展奠定坚实的物质基础。

2、加香加料是卷烟工艺中的关键环节，是有效提升卷烟抽吸品质，形成卷烟特有风格的有效手段之一。目前我国烟草中添加的烟用香料大多是采用传统方法萃取再加以调配所得，虽然生产操作简单，但也存在香气单调、改善卷烟抽吸效果不明显等缺点。利用微生物对香原料进行发酵，可以增加传统提取香料中多种香气物质的含量，提升香气丰富性。而现有工业产香微生物种类偏少，发酵香料类型有限，迫切需要寻找并筛选新的能够发酵产生特殊香气的微生物菌株，以拓展烟用香料的丰富性，满足开发特色型卷烟的需求。

3、为了解决以上问题，提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的类芽孢杆菌。本发明的目的还在于提供所述类芽孢杆菌在卷烟生产中的应用。本发明提供的类芽孢杆菌si92为首次被分离得到，经鉴定为微生物新种，目前未有任何关于所述类芽孢杆菌si92及相关应用的公开报道。

2、本发明提供了一种类芽孢杆菌，其微生物学分类命名为类芽孢杆菌si92，拉丁文学名为paenibacillus sp.si92，已于2022年3月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmcc no.1.19445。本发明还公开了所述类芽孢杆菌si92的分离、培养和鉴别的方法以及其用于发酵制备生物香料的用途。本发明的类芽孢杆菌鉴定为一种新的细菌，能利用葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、葡萄糖酸盐等，用其制备得到的生物香料用于卷烟加香中，对增加烟气特殊发酵型酸香效果明显。

3、除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

4、本发明通过以下技术方案实现上述目的。

5、本发明第一方面涉及一种具有产香功能的微生物类芽孢杆菌si92，分离至云南昆明烟草种植基地烟草根际土壤样品，对其进行了形态学、生理生化性质和16s rdna分析，鉴定结果表明其属于类芽孢杆菌，微生物学分类命名为类芽孢杆菌paenibacillus sp.，已于2022年03月08日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：cgmcc)保藏，保藏编号为cgmcc no.1.19445，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。

6、本发明分离得到的微生物类芽孢杆菌si92菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：在大多数培养基上生长良好，在r2a琼脂培养基上，菌落边缘整齐，中间凸起，呈乳白色潮湿的菌落。茶酚-as-bi-磷酸水解酶，硝酸还原酶呈阳性，色氨酸水解，精氨酸水解，脲酶，碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，类酯酶(14)，颉氨酸芳胺酶，胱氨酸芳胺酶，胰蛋白酶，α-半乳糖甙酶，β-半乳糖甙酶，β-糖醛酸甙酶，α-葡萄糖甙酶，明胶液化呈阴性，产生硫化氢，产生黑色素。能利用葡萄糖、甘露糖、麦芽糖，葡萄糖酸盐，n-乙酰-葡萄糖胺，不能利用阿拉伯糖，甘露醇，葵酸、己二酸、苹果酸、柠檬酸等。主要的脂肪酸包括anteiso-c15:0,c16:0,anteiso-c17:0和iso-c15:0。细胞的呼吸醌为甲基萘醌-7(mk-7)。

7、本发明所分离得到的类芽孢杆菌si92的16s rdna基因核苷酸序列如序列表所示，该序列已递交国际核苷酸序列数据库(genbank)，序列检索号：ol307707。

8、本发明第二方面涉及一种分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的类芽孢杆菌si92的方法，包括以下步骤：

9、a、从自然环境中取土壤样品，加无菌水，摇床振荡，加无菌水继续稀释并涂布于lb平板培养基上进行培养，挑选单菌落，纯化，得到分离的微生物菌液，加入甘油、置于冰箱中备用；

10、b、将步骤a分离的微生物菌液接种到lb液体培养基中，摇床振荡，培养至菌液浓度为光密度od＝2.0，制得种子液；

11、c、将步骤b制得的种子液接种在筛选培养基中，摇床振荡，筛选产生香气的微生物，构建系统发育树进行分子鉴别。

12、上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的微生物类芽孢杆菌si92的方法，步骤a中的土壤样品为自云南昆明的烟草根际土壤样品。

13、上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的类芽孢杆菌si92的方法，步骤a中lb平板培养基的组成如下：每950ml双蒸水(ddh2o)中加入：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；调节ph至7.0，定容至1000ml，再加入琼脂粉15g，121℃，20min高压灭菌，待冷却至50-60℃时，倒制平板。

14、上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的类芽孢杆菌si92的方法，步骤a中摇床振荡温度为30℃，振荡速度180rpm，振荡时间30min，用无菌水稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，在lb平板培养基上的培养温度为30℃，培养时间48h，甘油的加入量为分离的微生物菌液体积的20％，冰箱温度为-80℃。

15、上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的类芽孢杆菌si92的方法，步骤b中lb液体培养基的组成如下：每950ml双蒸水(ddh2o)中加入：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；调节ph至7.0，定容至1000ml，121℃，20min高压灭菌。

16、上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的类芽孢杆菌si92的方法，步骤b中摇床振荡温度为30℃，振荡速度160rpm；步骤c中摇床振荡温度为30℃，振荡速度160rpm，振荡时间3-5天。

17、上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的类芽孢杆菌si92的方法，步骤c中筛选培养基为r2a液体培养基，组成如下：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸钠0.3g；磷酸氢二钾0.3g；硫酸镁0.05g；蒸馏水1000ml，ph7.2。

18、本发明第三方面涉及一种本发明第一方面所述的类芽孢杆菌si92用于发酵制备生物香料的应用，利用所述的类芽孢杆菌si92发酵制备生物香料的方法，包括如下步骤：

19、将类芽孢杆菌si92活化、扩大培养后接种于发酵培养基中，28℃下摇瓶培养6天，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，浓缩后所得澄清红棕色液体，即为所述生物香料。

20、将类芽孢杆菌si92经过试管斜面培养和种子培养后接种于发酵培养基中。

21、(1)试管斜面培养

22、采用斜面保藏培养基，培养基为r2a琼脂培养基，培养基的配方为：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000ml，ph7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，摆成斜面，接种类芽孢杆菌si92菌株，28℃下培养1周，获得试管菌种；

23、(2)种子培养

24、采用种子培养基，种子培养基的配方为：糊精120g，大豆粉40g，酵母膏2g，色氨酸0.5g，β-丙氨酸5g，硫酸镁0.5g，磷酸铵0.2g，蒸馏水定容到1000ml，ph7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，从步骤(1)的试管斜面上挑取部分菌丝体接入种子液中，28℃摇瓶培养36h，获得液体菌种；

25、(3)发酵培养

26、取5l发酵培养基，发酵培养基的配方为：大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水1000ml，ph7.2。将培养基在121℃下灭菌30min，将步骤(2)中的液体菌种按10％的接种量接到发酵培养基中，摇瓶培养6天，培养温度为28℃，得到发酵液。

27、本发明的第四方面涉及本发明第三方面所述应用中类芽孢杆菌si92发酵所得生物香料在卷烟加香中的应用。该生物香料明显区别于于普通酸醋类、酸果提取类酸香，用于卷烟加香中，对增加卷烟发酵型酸香效果明显。类芽孢杆菌si92能分解利用葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、葡萄糖酸盐等，用其制备得到的生物香料用于卷烟加香中，对增加烟气特殊发酵型酸香效果明显。

28、本发明具有以下有益效果：

29、1.从云南昆明烟草种植基地烟草根际土壤样品中分离得到的纯培养菌株中，筛选得到一株新菌株si92，其能利用葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、葡萄糖酸盐等，经形态学研究、生理生化分析、分子生物学鉴定，结果表明该菌株为微生物新种，属于类芽孢杆菌，微生物学分类命名为类芽孢杆菌si92，拉丁文学名为paenibacillus sp.si92；保藏编号为cgmccno.1.19445。

30、2.本发明从土壤中分离得到的类芽孢杆菌si92，其发酵制备的生物香料酸香特征凸显，明显区别于普通酸醋类、酸果提取类酸香，用于卷烟加香中，对增加烟气发酵型酸香效果明显，能够拓展烟用香料的丰富性，进一步满足特色型卷烟的开发需求。

31、3.该菌株易于保存、活化，发酵过程易控，发酵香料质量稳定、成本低廉，易于规模化生产和应用。