一种核酸分子、环状单体重组抗原及应用的制作方法

本发明属于免疫检测，具体涉及一种核酸分子、环状单体重组抗原及应用。

背景技术：

1、抗原表位，又称抗原决定簇或抗原决定基(antigenic determinant，ad)指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。抗原表位可能是由一级结构决定的线性连续的，也可能是由三级结构决定的不连续的空间构象。表位是抗原免疫原性的基础，研究抗原表位，对于设计具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子及新型诊断试剂具有重大意义，尤其是在制作特异性、稳定性良好的诊断试剂盒中尤为重要。

2、免疫检测所针对的血清样本中含有的抗体类型包含构象型表位抗体和线性表位抗体两类。目前重组抗原的构象表位和线性表位的稳定性尚有不足，需要低温保存，并且只能在一定时间范围内保持活性。抗原的一级结构，即组成蛋白质多肽链的线性氨基酸序列决定其线性表位。在一级结构基础上，通过肽链的空间折叠形成固定的三级空间结构，空间结构上即包含有抗原的构象表位。抗原的三级结构通常由分子间作用力形成，少有共价键维持，主要靠次级键，包括氢键、疏水键、盐键以及范德华力等，这些次级键可存在于一级结构序号相隔很远的氨基酸残基的r基团之间，易受环境中ph、温度、离子强度等的影响，有变动的可能性，故随着储存条件变化和时间推移，三级结构会逐渐改变，最终导致抗原构象表位消失，导致抗原无法被对应构象表位抗体识别。而当抗原发生一级氨基酸序列的降解时，会导致线性表位的消失，从而使抗原的免疫检测能力进一步变弱。通常相比于线性表位，构象表位稳定性更差。

3、为了提高重组抗原的抗原表位稳定性，一般采用的方法有对抗原进行部分氨基酸的突变、将重组抗原与促溶标签进行融合表达、优化重组抗原的储存缓冲液和工作缓冲液等。氨基酸突变方法需要经过大量的筛选工作，且氨基酸的变动可能会影响抗原与抗体的反应活性；促溶标签对抗原稳定性的影响比较随机，也需要一定程度的筛选；储存和工作缓冲液的优化只能在原有基础上对抗原稳定性有一定程度的提升，无法从根源上解决抗原不稳定的问题。

4、因此，目前免疫诊断和疫苗的研发中亟需一种表位稳定性高的重组抗原。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，提供了一种核酸分子，以及由所述核酸分子编码的含有位点特异性共价键的环状单体重组抗原。蛋白质骨架环化是将线性肽的羧基端和氨基端通过酰胺键进行环合形成环状分子。本发明的环状单体重组抗原的性能大幅提升，蛋白折叠域与非折叠域的构象熵大幅降低，进而使抗原表位稳定性显著提高。在相同条件下，本发明的环状单体重组抗原比未环化重组抗原的免疫活性和稳定性均提升了2-10倍。

2、为此，本发明第一方面提供一种非天然形成的核酸分子，其编码的肽链包括肽链a、肽链b和能够与特异性抗体相结合的肽链c；所述肽链a和肽链b之间能够形成位点特异性共价键；

3、所述核酸分子能够在宿主系统中表达，且表达的产物能自发形成能够与所述特异性抗体相结合的环状单体重组抗原。

4、在本发明的一些实施方式中，所述位点特异性共价键为异肽键。

5、在本发明的另一些实施方式中，所述肽链a有空间构象，且能够识别肽链b并催化形成位点特异性共价键。

6、在本发明的一些实施方式中，所述肽链a选自spycatcher、snoopcatcher和sdycatcher中的任意一种；优选为spycatcher。

7、在本发明的另一些实施方式中，所述肽链b选自spytag、snooptag和sdytag中的任意一种；优选为spytag。

8、在本发明的一些实施方式中，所述肽链c有空间构象；优选地，所述空间构象中所述肽链c的氨基端和所述肽链c的羧基端的距离不超过优选不超过更优选不超过

9、在本发明的一些优选的实施方式中，所述肽链a与所述肽链c之间设置氨基酸桥a；和/或所述肽链b与所述肽链c之间设置氨基酸桥；所述氨基酸桥a和氨基酸桥b是柔性的。

10、在本发明的另一些实施方式中，所述氨基酸桥a和氨基酸桥b的总长度为6～50个氨基酸；优选为15～30个氨基酸。

11、在本发明的一些具体实施方式中，所述氨基酸桥a的长度为5～30个氨基酸；优选为10～20个氨基酸。

12、在本发明的一些实施方式中，所述氨基酸桥a和氨基酸桥b各自独立地由无侧链或只含有亲水侧链的氨基酸组成，且所述氨基酸桥a和氨基酸桥b均不含有带巯基侧链和/或带甲基侧链的氨基酸；优选地，所述亲水侧链为羟基。

13、在本发明的一些实施方式中，所述氨基酸桥a和氨基酸桥b中均包括重复序列；优选地，所述重复序列为gg或gs；进一步优选地，所述重复序列的重复倍数为2～6倍。

14、本发明第二方面提供了一种环状单体重组抗原，其包括如本发明第一方面所述的核酸分子所编码的肽链。

15、在本发明的一些实施方式中，所述重组抗原选自hcv抗原、nse抗原、pgi抗原、ck-mb抗原、prl抗原和tp抗原中的任意一种。

16、本发明第三方面提供了一种制备如本发明第二方面所述的环状单体重组抗原的方法，其包括如下步骤：

17、s1，构建包括如本发明第一方面所述的核酸分子的表达载体；

18、s2，将所述表达载体转导至宿主系统中；

19、s3，培养所述宿主并诱导所述宿主系统表达所述的环状单体重组抗原。

20、本发明第四方面提供了一种如本发明第二方面所述的环状单体重组抗原或第三方面所述方法制备的环状单体重组抗原在制备免疫检测试剂、免疫检测标准品或者疫苗中的应用。

21、在本发明的一些实施方式中，所述免疫检测为光激化学发光免疫检测。

22、本发明的有益效果为：本发明提供的环状单体重组抗原的构象中含有通过位点特异性共价键形成的环状结构，使得蛋白折叠域与非折叠域的构象熵大幅降低，进而使得抗原表位稳定性显著提高。在相同条件下，本发明的环状单体重组抗原比未环化重组抗原的免疫活性和稳定性均提升了2-10倍，能够较好地应用在免疫检测、制备参考品或者制备疫苗中。

技术特征：

1.一种非天然形成的核酸分子，其编码的肽链包括肽链a、肽链b和能够与特异性抗体相结合的肽链c；所述肽链a和肽链b之间能够形成位点特异性共价键；

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述位点特异性共价键为异肽键。

3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其特征在于，所述肽链a有空间构象，且能够识别肽链b并催化形成位点特异性共价键。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的核酸分子，其特征在于，所述肽链a选自spycatcher、snoopcatcher和sdycatcher中的任意一种；优选为spycatcher；和/或，所述肽链b选自spytag、snooptag和sdytag中的任意一种；优选为spytag。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的核酸分子，其特征在于，所述肽链c有空间构象；优选地，所述空间构象中所述肽链c的氨基端和所述肽链c的羧基端的距离不超过优选不超过更优选不超过

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的核酸分子，其特征在于，所述肽链a与所述肽链c之间设置氨基酸桥a；和/或所述肽链b与所述肽链c之间设置氨基酸桥b；所述氨基酸桥a和氨基酸桥b是柔性的。

7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述氨基酸桥a和氨基酸桥b的总长度为6～50个氨基酸；优选为15～30个氨基酸。

8.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，所述氨基酸桥a的长度为5～30个氨基酸；优选为10～20个氨基酸。

9.根据权利要求6-8中任意一项所述的核酸分子，其特征在于，所述氨基酸桥a和氨基酸桥b各自独立地由无侧链或只含有亲水侧链的氨基酸组成，且所述氨基酸桥a和氨基酸桥b均不含有带巯基侧链和/或带甲基侧链的氨基酸；优选地，所述亲水侧链为羟基。

10.根据权利要求6-9中任意一项所述的核酸分子，其特征在于，所述氨基酸桥a和氨基酸桥b中均包括重复序列；优选地，所述重复序列为gg或gs；进一步优选地，所述重复序列的重复倍数为2～6倍。

11.一种环状单体重组抗原，其包括如权利要求1-10中任意一项所述核酸分子所编码的肽链。

12.根据权利要求11所述的重组抗原，其特征在于，所述重组抗原选自hcv抗原、nse抗原、pgi抗原、ck-mb抗原、prl抗原和tp抗原中的任意一种。

13.一种制备如权利要求11或12所述的环状单体重组抗原的方法，其包括如下步骤：

14.一种如权利要求11或12所述的环状单体重组抗原或权利要求13所述方法制备的环状单体重组抗原在制备免疫检测试剂、免疫检测标准品或者疫苗中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述免疫检测为光激化学发光免疫检测。

技术总结本发明涉及一种核酸分子、环状单体重组抗原及应用。所述环状单体重组抗原包括所述核酸分子编码的肽链，所述肽链包括肽链A、肽链B和能够与特异性抗体相结合的肽链C；所述肽链A和肽链B之间能够形成位点特异性共价键。本发明提供的环状单体重组抗原的构象中含有通过位点特异性共价键形成的环状结构，使得蛋白折叠域与非折叠域的构象熵大幅降低，进而使得抗原表位稳定性显著提高。在相同条件下，本发明的环状单体重组抗原比未环化重组抗原的免疫活性和稳定性均提升了2‑10倍，能够较好地应用在制备免疫检测试剂、免疫检测标准品或者疫苗中。技术研发人员：陈英豪,洪琳,刘宇卉,李临受保护的技术使用者：上海索昕生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18