一种快速激活雷帕霉素合成的发酵方法

本发明属于生物医药发酵领域，具体涉及一种快速激活雷帕霉素合成的发酵方法。

背景技术：

1、雷帕霉素（rapamycin）是由吸水链霉菌（ strepomyces hygroscopicus）发酵产生的一种33元大环内酯类免疫抑制剂，因其具有低毒高效的特点（较环孢菌素），1999年被美国食品和药物管理局（fda）批准为肾移植的免疫抑制药物（商品名为rapamune）。此外，近年来研究还发现雷帕霉素具有免疫抑制、抗真菌、抗炎症、抗癌症、抗动脉粥样硬化、神经保护和抗衰老等多种生物活性。因此，雷帕霉素具有广阔的临床应用前景和较高的市场价值。

2、作为一种典型的次级代谢产物，雷帕霉素生物合成十分复杂，且受到胞内多种代谢调控体系的调节。目前，国内外针对雷帕霉素发酵产量的提升已开展了多方面的工作，主要包括培养基与发酵工艺优化、菌株物理和化学诱变、菌株基因工程改造等策略。尽管上述方法在一定程度上使得雷帕霉素的发酵产量得到有效提升，但其工作量大，且均面临菌株的稳定性差、回复突变率高、菌株易退化等问题。因此，如何建立快速激活雷帕霉素生物合成胞内代谢调控体系的发酵策略，将为雷帕霉素产量的提升提供一个新途径。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种外源添加化学激发剂策略，快速激活雷帕霉素合成的发酵方法，具体的化学激发剂种类及其添加策略如下：

2、① 本发明中涉及的化学激发剂种类包括：二甲基亚砜（c2h6os）、氯化钪（sccl3）和丁酸钠（c4h7nao2）；

3、② 化学激发剂浓度：二甲基亚砜：0.75%（v/v），氯化钪：75µmol/l，丁酸钠：75µmol/l；

4、③ 化学激发剂外源添加方法：配制上述化学激发剂溶液，采用无菌的针头滤器过滤后，在各分批发酵过程中于不同时间点分别加入上述1种无菌的化学激发剂溶液，其中丁酸钠添加时间为发酵后48h，二甲基亚砜添加时间为发酵后72h，氯化钪添加时间为发酵后96h。

5、作为本发明的技术特征，所采用的具体发酵操作步骤如下：

6、① 菌株的活化：将保存的菌株接种于固体试管斜面培养基，于28℃恒温培养10-14天；

7、② 液体种子培养：在250ml三角瓶中装入50ml液体种子培养基，灭菌后放至室温，用接种环在雷帕霉素固体斜面培养基上取1-2环菌种于液体种子培养基中，于28℃、220rpm下恒温振荡培养48-50h，获得种子液；

8、③ 液体发酵培养：在250ml三角瓶中装入50ml液体发酵培养基，灭菌后放至室温，按10-12%接种量接入种子液，于28℃、220rpm下恒温振荡培养7天。

9、其中，在液体发酵培养过程中，丁酸钠（75µmol/l）将于接入种子液48h后进行添加，并在相同条件下继续发酵120h；二甲基亚砜（0.75%，v/v）将于接入种子液72h后进行添加，并在相同条件下继续发酵至96h；氯化钪（75µmol/l）将于接入种子液96h后进行添加，并在相同条件下继续发酵72h。

10、上述步骤中所用培养基组成如下：

11、① 固体斜面培养基：燕麦粉20 g/l，酵母粉4 g/l，甘露醇2.5 g/l琼脂20 g/l，ph7.0

12、② 液体种子培养基：可溶性淀粉20 g/l, 葡萄糖20 g/l，玉米粉10 g/l，蛋白胨6g/l，酵母粉6 g/l，酪蛋白1.5 g/l，mgso4•7h2o 0.25 g/l，k2hpo4 1.0 g/l，ph 7.0

13、③ 液体发酵培养基：葡萄糖45 g/l，可溶性淀粉15 g/l，黄豆饼粉40 g/l， (nh4)2so4 1 g/l，k2hpo4 1 g/l，ph 7.0

14、作为本发明的技术特征，所述的吸水链霉菌（ strepomyces hygroscopicus ha12）为 strepomyces hygroscopicus atcc 29253经紫外诱变后筛选获得。

15、本发明经过上述发酵操作后，通过采用单独添加上述3种化学激发剂，雷帕霉素的最终产量较出发菌株（112.59 mg/l）产量可提升1.65-1.83倍。

16、

技术特征：

1.一种快速激活雷帕霉素合成的发酵方法，其特征是在雷帕霉素发酵过程中，通过外源添加不同类型化学激发剂，雷帕霉素发酵产量快速提升。

2.如权利要求①所述方法，其特征外源添加的化学激发剂，包括二甲基亚砜、丁酸钠和氯化钪，且其最适添加浓度分别为0.75%（v/v）、75µmol/l和75µmol/l。

3.如权利要求①所述方法，外源添加3种化学激发剂的最优添加时间分别为雷帕霉素发酵接种后第48h（丁酸钠）、72h（二甲基亚砜）和96h（氯化钪）。

4.如权利要求①所述方法，上述外源添加二甲基亚砜的具体特征步骤如下：将在固体斜面培养基中活化的成熟菌株，采用接种环取1-2环至灭菌后的液体种子培养基中，于28℃、220rpm下恒温振荡培养48-50h后，按10-12%（v/v）接种量接入灭菌后的液体发酵培养基中，于28℃、220rpm下恒温振荡培养48h后，接入无菌丁酸钠（75µmol/l）溶液，并在相同条件下继续发酵120h，结束发酵并测定雷帕霉素发酵产量。

5.如权利要求①所述方法，上述外源添加二甲基亚砜的具体特征步骤如下：将在固体斜面培养基中活化的成熟菌株，采用接种环取1-2环至灭菌后的液体种子培养基中，于28℃、220rpm下恒温振荡培养48-50h后，按10-12%（v/v）接种量接入灭菌后的液体发酵培养基中，于28℃、220rpm下恒温振荡培养72h后，接入无菌二甲基亚砜（0.75%，v/v）溶液，并在相同条件下继续发酵96h，结束发酵并测定雷帕霉素发酵产量。

6.如权利要求①所述方法，上述外源添加氯化钪的具体特征步骤如下：将在固体斜面培养基中活化的成熟菌株，采用接种环取1-2环至灭菌后的液体种子培养基中，于28℃、220rpm下恒温振荡培养48-50h后，按10-12%（v/v）接种量接入灭菌后的液体发酵培养基中，于28℃、220rpm下恒温振荡培养96h后，接入无菌氯化钪（75µmol/l）溶液，并在相同条件下继续发酵72h，结束发酵并测定雷帕霉素发酵产量。

技术总结本发明公开了一种快速激活雷帕霉素合成的发酵方法。本发明通过在雷帕霉素液体分批发酵过程中，分别添加不同浓度的二甲基亚砜、丁酸钠和氯化钪等化学激发剂溶液，可快速激活雷帕霉素的生物合成，并显著提升雷帕霉素的发酵产量。本发明可为理性提升雷帕霉素等次级代谢产物发酵水平提供新的思路。技术研发人员：王成受保护的技术使用者：西北农林科技大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18