一种小鼠四倍体器官的制备方法

本发明涉及一种小鼠四倍体器官的制备方法，属于器官再生领域。

背景技术：

1、多倍体，即细胞含有三个或三个以上染色体组，常见于高等植物及鱼类中。在人体中多倍体（以四倍体、八倍体居多）主要存在于巨核细胞、破骨细胞、胎盘滋养层细胞、乳腺细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝脏细胞和皮肤中，它们一般是通过胞质融合或不断重复的dna复制和胞质分裂失败来实现多倍体状态的，且在各自组织中都具有重要的作用，对于多倍体在各器官中的具体作用尚不十分明确。目前对于四倍体细胞在小鼠体内出生后形成时期、所涉及的信号通路、一些作用机制都有研究报道。2000年有团队通过调控正常二倍体胚胎和四倍体胚胎在聚合时的状态，可以确定在一定条件下四倍体细胞是可以成功嵌合进胎儿组织中而非只嵌合进胚外组织。

2、在器官再生领域，由二倍体多能性干细胞制备异种嵌合器官的研究已经较为常见。2010年日本科学家将小鼠二倍体多能性干细胞注射入胰腺缺失的大鼠囊胚内，在大鼠体内再生小鼠胰腺。2023年，中国科学家将人二倍体多能性干细胞注射入肾脏缺陷的猪早期胚胎，通过胚胎移植，在28天胎猪内部分再生人体中肾。这些研究成果都令大家感到兴奋，异种嵌合技术为器官的异种再生带来了曙光。人体器官异种再生，存在伦理问题，人猪嵌合，国际惯例不超过28天，严重限制了人体器官异种再生的发展。四倍体器官也许可以突破28天的伦理限制，但由于制备得到的同种/异种嵌合体没有形成完整的器官，这是嵌合体器官研究所面临的巨大挑战。因此，需要提供一种制备嵌合体器官的方法。

技术实现思路

1、为了应对嵌合体器官研究中所具有的挑战，为了增加器官再生研究更多可能性，也为了一定程度上突破异种器官研究的伦理限制，本发明提供了一种四倍体器官制备的方法，具体方法如下：

2、本申请提供了一种小鼠四倍体器官的制备方法，包括：

3、将四倍体多能性干细胞注射入器官缺失的小鼠胚胎中，而后移植到小鼠输卵管及子宫中，获得小鼠四倍体器官；

4、或，早中期的器官缺失的小鼠胚胎与早中期的四倍体胚胎进行胚胎聚合，体外培养后移植入小鼠输卵管及子宫中，获得小鼠四倍体器官；

5、或，将器官缺失的小鼠多能性干细胞注射入四倍体胚胎中，移植入小鼠输卵管及子宫中，获得小鼠四倍体器官。

6、进一步，四倍体多能性干细胞的制备方法为：

7、将小鼠2-细胞时期二倍体胚胎电融合后，获得四倍体胚胎；

8、将四倍体胚胎进行体外培养至桑葚胚，得到四倍体桑葚胚，将四倍体桑葚胚去除透明带后培养于多能性干细胞培养体系中并置于培养箱中，经打散传代后获得四倍体多能性干细胞。

9、进一步，器官缺失的小鼠胚胎的制备方法为：

10、取1-细胞时期小鼠受精卵，对受精卵进行基因编辑操作后，体外连续培养，获得器官缺失的小鼠胚胎；

11、或，将器官关键基因连接重组酶系统的小鼠与诱导表达白喉毒素的小鼠交配，获取器官缺失的小鼠胚胎；

12、或，将器官基因敲除的杂合子小鼠所进行交配，从而获得器官缺失的小鼠胚胎。

13、器官缺失的小鼠胚胎包括基因编辑小鼠的着床前胚胎。

14、进一步，器官缺失的小鼠多能性干细胞的制备方法为：

15、将基因编辑小鼠的着床前胚胎去除透明带后培养于多能性干细胞培养体系中并置于培养箱中，经打散传代后，获得器官缺失的小鼠多能性干细胞。

16、进一步，器官包括肝脏、胰腺、心脏。

17、有益效果

18、1、本申请提供了一种由四倍体细胞形成小鼠体内四倍体器官的方法，成功制备了小鼠四倍体肝脏，对制备的小鼠10.5天、12.5天、13.5天、18.5天四倍体肝脏组织进行组织切片与抗体免疫荧光共定位检测，最终通过四倍体弥补的基因敲除小鼠能够顺利健康存活。确定形成的为四倍体肝脏组织。成功制备了小鼠四倍体胰腺和心脏，对制备的小鼠18.5天四倍体胰腺和心脏进行组织切片红色荧光检测，最终通过四倍体弥补的胰腺和心脏缺失的18.5天成体小鼠能够顺利健康存活，确定形成的为四倍体胰腺与心脏。

19、2、探索多倍体在嵌合体组织器官制备中应用的可能性，在三种常用嵌合体制备方法的基础上，进行了细节的优化：a.分离多能性干细胞系时所选取的胚胎阶段为桑椹胚，提高了多能性干细胞系的分离效率；b.制备注射供体细胞时过筛网，多次沉降，提高状态良好细胞的纯度；c.向胚胎中进行供体细胞注射时，胚胎所处的时期的选择，包括4-8-细胞时期和囊胚中期，以提高嵌合效率；d.剖取18.5天胚胎时，设置代乳母鼠以提高胎儿存活率。确定四倍体在组织器官再生中的适用性，具体体现为：a.四倍体能够在不同重要时期的胚胎中发生高效嵌合，能够进行缺失器官的弥补操作；b.所获得的嵌合结果，能够为异种器官或异种嵌合体器官的制备提供一种可能更为高效的思路；c.针对最近较为热门的人体器官异种再生的相关研究工作，四倍体器官的制备可以很好地缓解正常二倍体所存在的伦理限制，为突破体内发育时间伦理限制产生较为完整可进行移植尝试的器官提供一种可能。

技术特征：

1.一种小鼠四倍体器官的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述四倍体多能性干细胞的制备方法为：

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述器官缺失的小鼠胚胎的制备方法为：

4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，所述器官缺失的小鼠多能性干细胞的制备方法为：

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述器官包括肝脏、胰腺、心脏。

技术总结本发明涉及一种小鼠四倍体器官的制备方法，属于器官再生领域。本发明包括制备四倍体器官过程中获得的多能性干细胞或器官缺失的小鼠胚胎至少有一项为四倍体。当多能性干细胞为四倍体时，将四倍体多能性干细胞注射入器官缺失的小鼠胚胎内；当胚胎为四倍体时，将器官缺失多能性干细胞注射入四倍体胚胎中。这两种方法均可得到四倍体器官，该方法可推广至大鼠、人与动物异种嵌合的相关应用中。技术研发人员：林江维,魏姝,邹国威,张言言,李帅鹏,胡梅受保护的技术使用者：中国科学院昆明动物研究所技术研发日：技术公布日：2024/6/18