一种天然蓝色素及其生物合成方法与流程

本技术涉及生物催化与生物合成，尤其是一种天然蓝色素及其生物合成方法。

背景技术：

1、观蓝（indigoidine）是一种无毒的细菌天然蓝色产物，它是由观蓝合成酶，即一种非核糖体多肽合成酶(non-ribosomal peptide synthase，nrps)催化两分子l-谷氨酰胺缩合而成。观蓝呈明亮深邃的蓝色类似于靛蓝，能够作为新型天然蓝色素及染料应用于印染、食品和医药行业，已有报道其用于蛋白质类纤维织物的染色。

2、申请公布号为cn 109722401 a的中国专利公开了在谷氨酸棒杆菌中共表达来自于streptomyces lavendulae的观蓝合成酶的编码基因（bpsa）和bacillus subtilis的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的编码基因（sfp），底物l-谷氨酰胺添加量为11.68g/l，18℃条件下0.8mm iptg诱导继续培养48h后，观蓝产量为1.75g/l；申请公布号为cn 109722401 a的中国专利公开了在大肠杆菌中共表达观蓝合成酶，4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶以及谷氨酰胺合成酶的编码基因，以l-谷氨酸盐为底物，生物转化制备观蓝，转化24h后，观蓝的产量达到5.38g/l；wehrs, m.等人将来源于s. lavendulae的观蓝合成酶的编码基因（bpsa）和b. subtilis的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的编码基因（sfp）整合至酿酒酵母基因组，以葡萄糖为底物在2l发酵罐培养72h，观蓝产量达到980mg/l（production efficiency ofthebacterial non-ribosomal peptide indigoidine relies on the respiratorymetabolic state ins. cerevisiae. microb. cell fact.2018, 17, no. 193）。mingzhao等人在变铅青链霉菌中建立高效的表达调控系统精确调控来源于streptomycesalbusj1704观蓝合成酶编码基因（indc），以甘油为底物在4l发酵罐上培养72h，观蓝产量达到46.27g/l（establishment of an efficient expression and regulation systeminstreptomycesfor economical and high-level production of the natural bluepigment indigoidine.j agric food chem journal of agricultural and foodchemistry2024 72 (1), 483-492）。

3、上述研究分别在谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、酵母菌和变铅青链霉菌中使用不同来源的观蓝合成酶以及不同底物实现观蓝的生物合成，但上述文献中均未发现n-乙酰观蓝。

技术实现思路

1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种天然蓝色素及其生物合成方法。本技术获得的天然蓝色素（n-乙酰观蓝）由于乙酰基的保护作用，n-乙酰观蓝相比观蓝极性和水溶性降低，不易褪色，色彩更加明亮，具有十分广阔的应用范围以及工业化生产的前景。

2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：

3、本技术提供了一种天然蓝色素，所述天然蓝色素的化学名称为n-乙酰观蓝（n-acetyl-indigoidine），分子式为c12h10n4o5，化学结构如式i所示；

4、

5、式i。

6、在本技术中，本技术新得到一种新的天然蓝色素（n-乙酰观蓝），通过质谱、核磁等推断出它的分子结构如式i所示，分子式为c12h10n4o5，相对分子质量为289.9，最大吸收波长为584nm，13c cpmas核磁共振谱δ=172.23 ppm和δ= 24.90ppm分别出现乙酰基上的-c=o和-ch3的特征峰，相比观蓝，颜色更加鲜艳明亮。

7、n-乙酰观蓝中的氨基与乙酰基形成酰胺结构，降低了n-乙酰观蓝的极性以及亲水性。与观蓝相比，n-乙酰观蓝更加稳定，不易褪色，同时获得更好的色彩明亮度，具有十分广阔的应用范围以及工业化生产的前景。

8、本技术还提供了上述天然蓝色素的生物合成方法，所述生物合成方法利用代谢工程菌表达观蓝合成酶以及磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶催化谷氨酰胺与n-乙酰谷氨酰胺生物合成天然蓝色素。

9、本技术经过大量实验发现，利用代谢工程菌表达观蓝合成酶以及磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶催化谷氨酰胺与n-乙酰谷氨酰胺的混合物作为底物可以生物合成天然蓝色素（n-乙酰观蓝），而代谢工程菌将单一的谷氨酰胺或单一的n-乙酰谷氨酰胺作为底物均不能合成n-乙酰观蓝。

10、作为本技术所述天然蓝色素的生物合成方法的优选实施方式，所述观蓝合成酶的编码基因包括观蓝合成酶编码基因bpsa或观蓝合成酶编码基因indc；

11、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的编码基因包括磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因entd或磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因indb。

12、本技术新发现采用含观蓝合成酶编码基因bpsa、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因entd的代谢工程菌能将谷氨酰胺和n-乙酰谷氨酰胺混合物作底物合成新化合物n-乙酰观蓝。经过实验可知，代谢工程菌将单一的谷氨酰胺或单一的n-乙酰谷氨酰胺作为底物均不能合成n-乙酰观蓝。

13、本技术向宿主菌导入观蓝合成酶编码基因indc和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因indb也能将谷氨酰胺和n-乙酰谷氨酰胺混合物作底物合成新化合物n-乙酰观蓝。

14、在一些具体的实施例中，所述观蓝合成酶编码基因bpsa的核苷酸序列如seq idno：1所示，所述观蓝合成酶编码基因indc的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因entd的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因indb的核苷酸序列如seq id no：4所示。

15、本技术所涉及的观蓝合成酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶可以来源于任何物种，例如观蓝合成酶来源于streptomyces lavendulae，观蓝合成酶的编码基因bpsa的核苷酸序列如seq id no：1所示，或观蓝合成酶来源于streptomyces chromofuscusatcc49982，观蓝合成酶的编码基因indc的核苷酸序列如seq id no：2所示。例如磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶来源于corynebacterium glutamicum，磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的编码基因entd的核苷酸序列如seq id no：3所示，或磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶来源于streptomyceschromofuscusatcc49982，编码基因indc的核苷酸序列如seq id no：4所示，上述仅仅举例，观蓝合成酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶不同来源均在本技术的保护范围之内。

16、作为本技术所述天然蓝色素的生物合成方法的优选实施方式，所述代谢工程菌为：

17、向宿主菌导入观蓝合成酶编码基因bpsa和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因entd构建得到代谢工程菌；

18、或者，

19、向宿主菌导入观蓝合成酶编码基因indc和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因indb构建得到代谢工程菌。

20、作为本技术所述天然蓝色素的生物合成方法的优选实施方式，所述代谢工程菌的构建方法，包括以下步骤：

21、将观蓝合成酶编码基因bpsa和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因entd分别经过pcr扩增，连接至质粒中，得到代谢工程菌；

22、或者，将观蓝合成酶编码基因indc和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因indb分别经过pcr扩增，连接至质粒中，得到代谢工程菌。

23、在一些具体实施例中，所述代谢工程菌为大肠杆菌重组菌株hg-n-idg01，所述大肠杆菌重组菌株hg-n-idg01由表达载体pcdfduet-bpsa-entd导入大肠杆菌bl21(de3)构建而得。

24、所述表达载体pcdfduet-bpsa-entd是由来源于s. lavendulae的观蓝合成酶编码基因bpsa及来源于c. glutamicum的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因entd分别经过pcr扩增、基因合成、连接至表达载体pcdfduet-1获得；

25、所述表达载体pcdfduet-bpsa-entd的构建方法，具体步骤如下：

26、（1）观蓝合成酶编码基因bpsa、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因entd，由擎科生物科技有限公司进行基因合成。

27、（2）使用宝生物公司的无缝克隆试剂盒依次将bpsa、entd基因片段插入pcdfduet-1质粒两个多克隆位点，得到重组质粒pcdfduet-bpsa-entd。

28、（3）使用化学转化法将pcdfduet-bpsa-entd转至大肠杆菌bl21(de3)，得到大肠杆菌重组菌株hg-n-idg-01。

29、在一些具体实施例中，所述代谢工程菌为过表达来源于s.chromofuscusatcc49982观蓝合成酶编码基因（indc）以及磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因（indb）大肠杆菌重组菌株hg-n-idg02，所述重组菌株hg-n-idg02由表达载体pcdfduet-indc-indb导入大肠杆菌bl21(de3)构建而得。

30、所述表达载体pcdfduet-bpsa-entd是由观蓝合成酶编码基因indc、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因indb分别经过pcr扩增、基因合成、连接至表达载体pcdfduet-1获得。

31、在一些具体实施例中，所述代谢工程菌是谷氨酸棒状杆菌（c. glutamicum）重组菌株hg-n-idg03、酿酒酵母（s. cerevisiae）重组菌株hg-n-idg04、变铅青链霉菌（s.lividans）重组菌株hg-n-idg05中的一种。

32、其中，所述谷氨酸棒状杆菌（c. glutamicum）重组菌株hg-n-idg03是由表达载体pxmj19-bpsa-entd导入谷氨酸棒状杆菌atcc13032构建而得。

33、所述表达载体pxmj19-bpsa-entd是由观蓝合成酶编码基因bpsa、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因entd分别经过pcr扩增、连接至表达载体pxmj19获得；

34、所述表达载体pxmj19-bpsa-entd的构建方法，具体步骤如下：

35、（1）观蓝合成酶编码基因bpsa、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因entd，是以质粒pcdf-bpsa-entd为模板，pcr扩增而得。

36、（2）使用宝生物公司的无缝克隆试剂盒将bpsa、entd基因片段插入pxmj19质粒多克隆位点，得到重组质粒pxmj19-bpsa-entd。

37、（3）利用电转法将重组质粒pxmj19-bpsa-entd转入谷氨酸棒状杆菌atcc13032中，得到谷氨酸棒状杆菌（c. glutamicum）重组菌株hg-n-idg03。

38、其中，酿酒酵母（s. cerevisiae）重组菌株hg-n-idg04由表达载体prs425-bpsa-entd导入酿酒酵母invsc1构建而得。

39、所述表达载体prs425-bpsa-entd是由来源于s. lavendulae的观蓝合成酶编码基因bpsa及来源于c. glutamicum的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因entd分别经过pcr扩增、基因合成、连接至表达载体prs425获得；

40、所述表达载体prs425-bpsa-entd表达载体的构建方法，具体的步骤如下：

41、（1）观蓝合成酶编码基因bpsa、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因entd，由擎科生物科技有限公司进行基因合成。

42、（2）将bpsa、entd基因片段插入prs425质粒多克隆位点，得到重组质粒prs425-bpsa-entd。

43、（3）利用醋酸锂转化法将重组质粒及prs425-bpsa-entd转入酿酒酵母invsc1，得到重组菌株hg-n-idg-04。

44、其中，变铅青链霉菌（s. lividans）重组菌株hg-n-idg05由表达载体pkch-pkaso-bpsa-entd导入变铅青链霉菌tk24构建而得。

45、所述表达载体pkch-pkaso-bpsa-entd是由潮霉素抗性基因b（hygr）、pkaso启动子、来源于s. lavendulae的观蓝合成酶编码基因bpsa、来源于c. glutamicum的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因entd、终止子，分别经过pcr扩增、基因合成、连接至质粒pkc1139获得；

46、所述表达载体pkch-pkaso-bpsa-entd表达载体的构建方法，具体的步骤如下：

47、（1）perme-slglna-slarga基因序列、潮霉素b抗性基因序列和pkaso-bpsa-entd基因序列由擎科生物科技有限公司进行基因合成。

48、（2）将潮霉素b抗性基因片段、pkaso-bpsa-entd基因片段插入pkc1139质粒多克隆位点，得到重组质粒pkch-pkaso-bpsa-entd。

49、（3）利用结合转移法，将重组质粒pkch-pkaso-bpsa-entd依次转入变铅青链霉菌tk24，得到变铅青链霉菌（s. lividans）重组菌株hg-n-idg05。

50、本技术构建的大肠杆菌（e. coli）重组菌株hg-n-idg01、hg-n-idg02、谷氨酸棒状杆菌（c. glutamicum）重组菌株hg-n-idg03、酿酒酵母（s. cerevisiae）重组菌株hg-n-idg04、变铅青链霉菌（s. lividans）重组菌株hg-n-idg05通过质粒高效表达观蓝合成酶、4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，均实现催化谷氨酰胺和n-乙酰谷氨酰胺为底物生物合成n-乙酰观蓝。

51、本技术的代谢工程菌可以作为细胞催化剂，催化底物合成新化合物-n-乙酰观蓝。

52、作为本技术所述天然蓝色素的生物合成方法的优选实施方式，所述质粒i包括pcdfduet、pxmj19、prs425、pkc1139质粒中的至少一种。

53、作为本技术所述天然蓝色素的生物合成方法的优选实施方式，所述pcr扩增采用序列如seq id no：5~30所示的引物扩增。

54、作为本技术所述天然蓝色素的生物合成方法的优选实施方式，所述宿主菌包括大肠杆菌（escherichia coli）、谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）、酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）和变铅青链霉菌（streptomyces lividans）中的至少一种。

55、优选地，所述大肠杆菌（escherichia coli）包括大肠杆菌bl21(de3)；所述谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）包括谷氨酸棒状杆菌atcc13032；所述酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）包括酿酒酵母invsc1；所述变铅青链霉菌（streptomyceslividans）包括变铅青链霉菌tk24。

56、原始的大肠杆菌bl21(de3)、谷氨酸棒状杆菌atcc13032、酿酒酵母invsc1、变铅青链霉菌tk24均不能利用谷氨酰胺和n-乙酰谷氨酰胺合成n-乙酰观蓝，需要在大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母、链霉菌中导入相关酶基因至代谢工程菌中，才能实现生物催化n-乙酰观蓝的合成。

57、作为本技术所述天然蓝色素的生物合成方法的优选实施方式，所述生物合成方法，包括：离心收集诱导培养所述的代谢工程菌的菌体，使用含有磷酸盐缓冲液、谷氨酰胺、n-乙酰谷氨酰胺的催化液重悬菌体，催化后得到转化液，离心收集转化液中的天然蓝色素。

58、作为本技术所述天然蓝色素的生物合成方法的优选实施方式，所述催化液中谷氨酰胺的浓度为0.1～10g/l，n-乙酰谷氨酰胺的浓度为0.1-10g/l。

59、优选地，所述谷氨酰胺的浓度为1g/l，所述n-乙酰谷氨酰胺的浓度为1g/l。

60、本技术还提供了一种n-乙酰观蓝的纯化方法，离心收集上述催化液中的固体沉淀，使用二甲基酰胺（dmf）萃取沉淀中的n-乙酰观蓝，使用冷冻真空干燥蒸发二甲基酰胺，依次使用超纯水、甲醇、乙酸乙酯、正己烷进行洗涤固体，再次经过冷冻真空干燥得到n-乙酰观蓝样品。

61、本技术还提供了一种细胞催化剂，所述细胞催化剂含有上述代谢工程菌。

62、在一些具体实施例中，本技术提供了含有大肠杆菌重组菌株hg-n-idg01的细胞催化剂，其细胞催化剂的制备方法具体的步骤如下：挑取重组菌株hg-n-idg01单菌落转接至5ml lb培养基，培养基中含有50μg/ml链霉素，37℃，220rpm培养16h，以1％接种量接种至装有50ml zym培养基中，加入终浓度为50μg/ml链霉素以及终浓度为0.1mm的诱导剂iptg，30℃，220rpm，培养24h，离心收集菌体，所得菌体就是细胞催化剂。

63、在一些具体实施例中，本技术提供了含有谷氨酸棒状杆菌（c. glutamicum）重组菌株hg-n-idg03的细胞催化剂，其细胞催化剂的制备方法具体的步骤如下：挑取重组菌株hg-n-idg03单菌落转接至5 ml bhisg培养基，培养基中含有15μg/ml氯霉素和50μg/l生物素，30℃，220rpm培养16h，以1％接种量接种至50ml gap培养基中，培养基中加入终浓度为15μg/ml氯霉素和50μg/l生物素，30℃，220rpm，培养3h后加入终浓度为1mm iptg，继续培养24h，离心收集菌体，所得菌体即是细胞催化剂。

64、在一些具体实施例中，本技术提供了含有酿酒酵母（s. cerevisiae）重组菌株hg-n-idg04的细胞催化剂，其细胞催化剂的制备方法具体的步骤如下：挑取重组酿酒酵母hg-n-idg04单菌落接种到5ml的sc-leu液体培养基中，30℃，220rpm培养24h，4℃，1500 g离心5min，去除上清。用30ml的sc-leu液体培养基重悬细胞沉淀，同时添加10g/l半乳糖，30℃，220rpm培养24h。离心收集菌体，所得菌体即是细胞催化剂。

65、在一些具体实施例中，本技术提供了含有变铅青链霉菌（streptomyceslividans）重组菌株hg-n-idg05的细胞催化剂，其细胞催化剂的制备方法具体的步骤如下：用无菌枪头挑取ms培养基上生长4-5天的重组变铅青链霉菌hg-n-idg06，接种于含10mltsb培养基的初级摇瓶，28℃培养48h后，取1ml转接含50ml tsb培养基的二级摇瓶，28℃培养72h。离心收集菌体，即为细胞催化剂。

66、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：

67、本技术提供了一种天然蓝色素及其生物合成方法，本技术获得的天然蓝色素（n-乙酰观蓝）由于乙酰基的保护作用，与观蓝相比，n-乙酰观蓝最大吸收波长为584 nm，其极性和水溶性降低，不易褪色，色彩更加明亮，具有十分广阔的应用范围以及工业化生产的前景；本技术利用代谢工程菌表达观蓝合成酶以及磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶催化谷氨酰胺与n-乙酰谷氨酰胺生物合成n-乙酰观蓝，通过推断出此物质的结构并鉴定它是可作为一种新型天然蓝色素，本技术还在大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母、链霉菌等菌株中均能实现催化谷氨酰胺和n-乙酰谷氨酰胺合成n-乙酰观蓝。