双特异性抗原结合分子、重组融合蛋白及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种双特异性抗原结合分子、重组融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术：

1、乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，是女性健康的“第一杀手”。现代研究证明，乳腺癌的耐药复发和转移与肿瘤干细胞存在着密切关系。肿瘤干细胞是造成肿瘤复发、转移和耐药性产生的主要原因。

2、wnt相关信号通路是肿瘤干细胞维持自身特新的重要机制。wnt(wingless-typemmtv integration site family)蛋白家族包括至少19个成员，是一组富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，参与胚胎发育、细胞增殖分化甚至肿瘤发生等多个生物进程。依据其不同功能，wnt信号通路可分为经典通路和非经典通路。

3、经典通路具有细胞转化能力，对其研究已较广泛。经典wnts主要通过β-连接素(β-catenin)/t细胞因子(tcell factor，tcf)介导wnt靶基因的激活，进而调节细胞的分化和增殖，该途径成员有wnt1，wnt2，wnt3，wnt3a，wnt8等；另2条非经典通路为β-catenin非依赖性的wnt/极性通路和wnt/ca2+通路，通常不具备细胞转化能力，其成员包括wnt4，wnt5a，wnt5b，wnt7b，wnt11等。wnt信号途径不仅直接控制着大量生长、代谢相关基因的表达水平，还通过与其它信号通路之间复杂的相互作用间接影响着一系列下游基因的表达。

4、前期大量研究证明wnt3a具备促进干细胞增值和分化的能力，wnt3a是通过与其受体——卷曲蛋白和脂蛋白受体相关蛋白共受体结合，然后激活支架蛋白，并引起“破坏复合物”的解离。目前的研究发现wnt3a与多种恶性肿瘤相关。wnt3a是wnt/β-catenin经典途径中的主要配体。当存在wnt3a配体时，其会与细胞膜上的受体fzd(卷曲蛋白)结合，激活wnt信号通路。

5、在双敲除rnf43/znrf3突变(r/z dko)小鼠上皮细胞中，解除wnt3a的信号传递，可以有效阻止肿瘤的形成，而没有引发副作用。nicola fenderico等人证明，靶向wnt3a受体lrp6的纳米抗体，可以有效抑制肿瘤生长。所以有效解除肿瘤微环境中的wnt3a信号，将是有效的治疗乳腺癌的策略。然而，wnt3a不仅存在于肿瘤环境中，其在正常组织中也会大量存在。因而，如何准确对位于肿瘤组织中的wnt3a进行识别和定位，是决定抗癌效果好坏的关键所在。

6、此外，目前发现ror1是wnt5a的受体，ror1在乳腺癌化疗后表达显著提高，并且高表达ror1的乳腺癌细胞具备更强的干性，因而，在肿瘤的微环境中大量存在ror1。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子、重组融合蛋白及其制备方法和应用。本发明的重组融合蛋白既可以特异性识别ror1分子，因而能够在肿瘤微环境中富集，同时，阻断wnt3a与fzd的信号通路，其在与紫杉醇联用时能对乳腺癌干细胞具有60％以上的杀伤率。

2、本发明的目的之一，在于提供一种双特异性抗原结合分子，其包括：(i)ror1特异性结合分子，所述ror1特异性结合分子包含重链结构区和轻链结构区，所述重链结构区的氨基酸序列如seq id no：4所示，所述轻链结构区的氨基酸序列如seq id no：6所示，(ii)fzd8蛋白分子，所述fzd8蛋白分子的氨基酸序列如seq id no：5所示。由此，本发明的双特异性抗原结合分子的一端为可以识别ror1分子的抗体，另一端为fzd8蛋白，通过对与wnt5a结合的受体——ror1的特异性结合，因而能将本发明的双特异性抗原结合分子富集于肿瘤微环境中，同时通过阻断wnt3a信号通路，而实现对乳腺癌干细胞的增长的抑制。也即，通过对ror1的识别，而实现对本发明的双特异性抗原结合分子在肿瘤微环境中的富集，同时阻断ror1与wnt5a的信号通路。双特异性抗原结合分子的fzd8蛋白结构能识别wnt3a分子并与之结合，从而可以阻断wnt3a与其受体lpr6/lpr5的结合，阻断在肿瘤组织中的信号传导。

3、本发明的目的之二，在于提供一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包含前述的双特异性抗原结合分子。

4、本发明的目的之三，在于提供一种核苷酸序列，其编码前述的双特异性抗原结合分子，或编码前述的重组融合蛋白，编码所述重链结构区的核苷酸序列如seq id no：1所示，编码所述轻链结构区的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述fzd8蛋白分子的核苷酸序列如seq id no：2所示。

5、本发明的目的之四，在于提供一种载体，所述载体包含前述的核苷酸序列。

6、本发明的目的之五，在于提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含前述的载体。

7、本发明的目的之六，在于提供一种药物组合物，其包含前述的双特异性抗原结合分子，或前述的重组融合蛋白中的至少一种。

8、进一步的，本发明还提供了一种所述药物组合物与紫杉醇联用，在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

9、本发明的目的之七，在于提供一种试剂盒，其用于诊断罹患癌症或易患癌症的受试者，包含前述的双特异性抗原结合分子，或前述的重组融合蛋白中的至少一种。

10、本发明的目的之八，在于提供一种在体外杀伤表达ror1的细胞的生长的方法，所述方法包括向所述表达ror1的细胞施用药学上有效量或药学上有效剂量的前述的双特异性抗原结合分子，或前述的重组融合蛋白中的至少一种。

11、进一步的，包括如下步骤：

12、步骤s1：重组质粒的构建：

13、所述重组质粒包括同时携带fzd8和抗ror1抗体重链的序列的质粒一，和携带抗ror1抗体轻链的序列的质粒二；

14、步骤s2：质粒的转化和再提取：

15、将所述步骤s1得到的质粒一和质粒二对感受态细胞转化后，提取得到融合了ror1抗体轻链、ror1抗体重链和fzd8基因序列的质粒；

16、步骤s3：转染和蛋白表达，利用步骤s2得到的融合了ror1抗体轻链、ror1抗体重链和fzd8基因序列的质粒对293f细胞进行转染后进而表达，得到所述重组融合蛋白。

技术特征：

1.一种双特异性抗原结合分子，其特征在于，所述双特异性抗原结合分子包括：

2.一种重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白包含权利要求1所述的双特异性抗原结合分子。

3.一种核苷酸序列，其特征在于，编码权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，或编码权利要求2所述的重组融合蛋白，编码所述重链结构区的核苷酸序列如seq id no：1所示，编码所述轻链结构区的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述fzd8蛋白分子的核苷酸序列如seq id no：2所示。

4.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的核苷酸序列。

5.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求4所述的载体。

6.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，或权利要求2所述的重组融合蛋白中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，与紫杉醇联用，在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

8.一种试剂盒，其特征在于，用于诊断罹患癌症或易患癌症的受试者，包含权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，或权利要求2所述的重组融合蛋白中的至少一种。

9.一种在体外杀伤表达ror1的细胞的生长的方法，所述方法包括向所述表达ror1的细胞施用药学上有效量或药学上有效剂量的权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，或权利要求2所述的重组融合蛋白中的至少一种。

10.权利要求2所述的重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结本发明公开了一种双特异性抗原结合分子、重组融合蛋白及其制备方法和应用。本发明的双特异性抗原结合分子包括：ROR1特异性结合分子和FZD8蛋白分子，ROR1特异性结合分子包含重链结构区和轻链结构区，重链结构区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，轻链结构区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，FZD8蛋白分子的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。本发明的重组融合蛋白能够特异性结合于ROR1，而在肿瘤微环境中富集，同时，阻断Wnt3a与FZD的信号通路，其在与紫杉醇联用时，取得了良好的效果。技术研发人员：任宝永,刘鹏受保护的技术使用者：思格（苏州）生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18