厌氧反硝化菌及其菌剂与在油气集输管线中防治硫酸盐还原菌的用途的制作方法

本发明属于气田集输管线中采用微生物防治硫酸盐还原菌，更为具体的，涉及厌氧反硝化菌及其菌剂与在油气集输管线中防治硫酸盐还原菌的用途。

背景技术：

1、由于油气资源分布的不平衡，为了进一步降低运输损失和成本，提高生产效率和安全标准，许多地区选择使用管线进行油气储运，以满足不同地区的油气需求。因此，做好油气集输管线的防腐工作，在一定程度上促进了经济的发展。导致油气集输管线腐蚀的因素很多，如管道质量不合格、防腐技术不科学、外部环境因素的干扰等。其中，油气集输管线因硫酸盐还原菌(srb)腐蚀，造成的失效会对社会造成灾难性的安全后果和巨大的经济损失。虽然，采取化学法和物理法可控制硫酸盐还原菌和硫化物，但存在成本高、易产生抗药菌、易产生二次污染、治标不治本等缺点。

2、近年来，利用微生物抑制或消除硫酸盐还原菌腐蚀的研究已受到普遍的关注，该技术主要利用了微生物之间的竞争关系(硫酸盐还原菌和反硝化细菌dnb)来控制腐蚀，对环境及设备危害较小，成本相对较低。但目前，该技术主要研究对象为油田、油田水处理系统或回注系统的硫酸盐还原菌治理，如现有技术cn200610047730.2“控制油田硫酸盐还原菌危害的微生物制剂及其应用”中，解决了水处理系统或回注系统的生物防腐问题；cn201410569095.9“防治高温水体中srb的生物菌剂及其抑制srb的方法”中，解决了泵口腐蚀问题；cn201811202427.4“宽温环境下防治srb的复合生物菌剂及使用方法”中，解决了25～95℃的油井宽温环境下生物防腐。上述现有技术针对的对象主要为油井，而没有针对天然气井集输方面的研究；同时，涉及的微生物为好氧或兼性，即需要在好氧条件下发挥作用，而在缺氧的管线内，无法实现硫酸盐还原菌的防治效果(如图1所示)。

3、此外，现有技术cn201210176840.4“一株兼有高效解磷固氮及抑制病原真菌生长的产酸克雷伯氏菌”中，提供了一株克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)asp 15菌株，具有营养和促生作用，具有较高的解磷、固氮作用，还对多种植物病原真菌具有抑制作用，具有acc脱氨酶，分泌铁载体的能力；对拟枝孢镰刀菌(fusarium sporotrichiodes)等病原真菌抑菌率达57.8～84.8％以上；对病原菌生长的抑制主要是由其菌体细胞的快速生长，营养竞争，抢占生态位引起的。其可取代单一功能的解磷、固氮菌株，可单独或与其它微生物菌株复合形成微生物制剂，应用于农业生产。其中，asp 15菌株对植物病原真菌作用机理为：asp15菌株在好氧条件下，利用营养快速生长，通过营养竞争，抢占生态位从而剥夺植物病原真菌的生存条件，即涉及的asp15菌株并不能适应于气田集输管线中的厌氧环境。

技术实现思路

1、为了解决气田集输管线中由于硫酸盐还原菌而引起的腐蚀问题，本发明人从四川省威远县天然气采气井场采集返排液样品，通过多次富集培养基的培养，分离、纯化，得到产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)fxa313。同时，发现该菌株可防治油气集输管线中的硫酸盐还原菌，基于此，本发明提供厌氧反硝化菌及其菌剂与在油气集输管线中防治硫酸盐还原菌的用途。

2、为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：

3、本发明第一方面提供一种产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)，其保藏编号为cctcc no：m 20221209。

4、本发明所述的产酸克雷伯氏菌fxa313是一种厌氧反硝化菌，其保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2022年8月1日；保藏编号：cctcc no：m 20221209。

5、进一步的，所述产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)fxa313菌株的16s rdna序列如seq id no.1所示。

6、进一步的，所述产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)fxa313菌株的生理生化特征表现为：革兰氏染色阴性，短杆状，大小(长×宽)为0.3～0.7μm×0.2～0.3μm，厌氧；在双层反硝化培养基上，培养24小时后形成的菌落为圆形；培育48小时后形成的菌落为圆形，褐色，直径为0.5～1mm，边缘整齐，扁平湿润。

7、本发明第二方面提供一种菌剂，其包括保藏编号为cctcc no：m 20221209的产酸克雷伯氏菌。

8、根据本发明的具体实施方案，所述菌剂为菌悬液或菌体干粉。

9、根据本发明的具体实施方案，所述菌剂中的活菌量为：

10、液态菌剂中1.0×1010cfu/ml～2.0×1010cfu/ml；或

11、固态菌剂中1.0×1010cfu/g～2.0×1010cfu/g。

12、本发明第三方面提供一种制备所述的菌剂的方法，所述方法包括：

13、将所述保藏编号为cctcc no：m 20221209的产酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)接种于反硝化培养基，在20～30℃条件下，厌氧发酵，制备发酵液；经离心、冻干得到菌体干粉，或经离心、稀释菌体得到菌悬液。优选地，所得的菌悬液在稀释10倍条件下，od600值为0.51～1.02。

14、根据本发明的具体实施方案，所述反硝化培养基包括：

15、0.5～1.5g/l的kno3、4～6g/l的柠檬酸钠、0.5～1.0g/l的k2hpo4、0.5～1.0g/l的kh2po4和0.1～0.3g/l的mgso4·7h2o；

16、优选地，所述反硝化培养基包括1.0～1.5g/l的kno3、2～5g/l的柠檬酸钠、0.8～1.0g/l的k2hpo4、0.8～1.0g/l的kh2po4和0.2～0.3g/l的mgso4·7h2o；

17、优选地，所述反硝化培养基包括1.0g/l的kno3、5g/l的柠檬酸钠、0.7g/l的k2hpo4、0.7g/l的kh2po4和0.2g/l的mgso4·7h2o。

18、根据本发明的具体实施方案，所述反硝化培养基包括kno3 5～15份、柠檬酸钠40～60份、k2hpo4 5～10份、kh2po4 5～10份和mgso4·7h2o 1～3份。

19、本发明第四方面提供所述的保藏编号为cctcc no：m 20221209的产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)和/或所述的菌剂在防治硫酸盐还原菌中的应用。

20、根据本发明的具体实施方案，所述应用包括所述的保藏编号为cctcc no：m20221209的产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)和/或所述的菌剂应用于油气集输管线中防治硫酸盐还原菌。

21、本发明第五方面提供一种在油气集输管线中防治硫酸盐还原菌的方法，包括如下步骤：

22、a.称量硝酸盐和柠檬酸钠，溶解于水中，配制包括浓度为200～500mg/l的硝酸根离子和浓度为5～10mg/l的柠檬酸钠的营养液；

23、b.以体积比为1：5～10计，将营养液与所述的菌剂混合，得混合液；

24、c.将所得的混合液注入至气田集输管线中，其中，混合液的投加量为气田集输管线日经采出液体积的0.2％～2.0％倍。

25、根据本发明的具体实施方案，所述方法中，控制注入混合液后的气田集输管线中硝酸根的浓度为0.2～2mg/l，柠檬酸钠浓度为0.005～0.01mg/l。

26、在上述条件下，产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)fxa313菌株可快速繁殖，产生的反硝化中间产物no2-或n2o或no抑制硫酸盐还原菌(srb)生长，且可在油气集输管线表面形成有益菌膜，防止srb附着，减少srb对油气集输管线的腐蚀；

27、而当营养物质的浓度低于上述范围时，不利于fxa313菌株的快速繁殖，即不利于中间产物产生和生存空间竞争，srb抑制效率降低；

28、当营养物质的浓度高于上述范围时，fxa313菌株能快速繁殖，利于中间产物产生和生存空间竞争，但处理成本较高，不适用于油气集输管线中的硫酸盐还原菌长期防治。

29、在本技术方案中，涉及的名词解释包括：

30、生态位是指一个种群在生态系统中，在时间空间上所占据的位置及其与相关种群之间的功能关系与作用。表示生态系统中每种生物生存所必需的生境最小阈值。

31、在本技术方案中，将产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)fxa313菌株应用防治硫酸盐还原菌，涉及的机理包括：在油气集输管线的厌氧环境下，厌氧菌株fxa313利用营养液(硝酸根和柠檬酸)，进行快速繁殖生长，其中，在利用硝酸根生长时，产生的反硝化中间产物(no2-或n2o或no)抑制硫酸盐还原菌(srb)生长，且可在集输管线表面形成有益菌膜，防止硫酸盐还原菌附着，最终实现油气集输管线中硫酸盐还原菌的防治。

32、采用本技术方案，带来的有益技术效果为：

33、(1)本发明提供的产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)fxa313为厌氧菌，能够适应于油气集输管线中的厌氧环境，且在厌氧条件下有效抑制硫酸盐还原菌(srb)生长繁殖，即对油气集输管线的防腐起到了重要作用。

34、(2)本发明将产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)fxa313经发酵，制成菌活量为1.0×1010cfu/ml～2.0×1010cfu/ml(和/或1.0×1010cfu/g～2.01010cfu/g)菌剂，可为微生物防治提供选择，如：油气集输管线中的硫酸盐还原菌防治。

35、(3)本发明将产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)fxa313或其菌剂用于油气集输管线中的硫酸盐还原菌防治时，通过营养液种类及其比例、注入量等控制，有效抑制油气集输管线中的硫酸盐还原菌。